李西波，張旭，楊柳，張惠惠，張繼

(1.西北師范大學 生命科學學院，蘭州 730070；2.中國科學院蘭州化學物理研究所甘肅省天然藥物重點實驗室，蘭州 730000)

酸性蛋白酶是指在pH值為2.5～5.0的酸性條件下水解蛋白質(zhì)生成多肽和氨基酸的一類酶[1,2]，廣泛地應用于釀酒[3-10]、調(diào)味品釀造[11-14]、輕工[15,16]、皮革[17-19]以及飼料[20-22]等行業(yè)中，因此越來越引起人們的關注。在酸性蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，菌種性能對產(chǎn)量起決定作用，因此篩選高活力酸性蛋白酶菌種勢在必行。從自然界分離得到的菌種，由于其生產(chǎn)能力較低，一般不能滿足工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，采用物理或化學誘變方法選育高產(chǎn)的誘變菌株，彌補生產(chǎn)能力低的不足，這已成為一種常規(guī)的選育菌種技術，其中紫外線是最常用的一種物理誘變方法，它直接作用于嘧啶，影響DNA正常解鏈與堿基配對，使其形成嘧啶二聚體(主要是TT)，其優(yōu)點是危險性小、誘變效果較好[23-25]。

豆醬和醬油是中國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，深受國人喜愛，已成為中國調(diào)味品文化的象征，其獨特的風味是發(fā)酵醬醅中多種微生物相互協(xié)調(diào)、共同作用的結(jié)果[26,27]，尤其含有大量的產(chǎn)酸性蛋白酶菌株。本研究采用平板涂布法從醬醅中初篩出1株產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株JL-335作為誘變供試菌株，并采用紫外線誘變對菌株JL-335進行改造，以產(chǎn)酸性蛋白酶活力大小為評價標準，篩選產(chǎn)酶活力高且遺傳性能穩(wěn)定的突變株SKY-520，并確定了發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳工藝。通過對酸性蛋白酶催化條件的優(yōu)化以及對其熱穩(wěn)定性的研究來闡述蛋白酶的酶學性質(zhì)，為其進一步生產(chǎn)實踐提供了科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

醬醅：由河南建洛生物工程公司提供。

麩皮、豆粕：市售；瓊脂粉，蔗糖，干酪素，NaCl，KCl，F(xiàn)eCl3，MgSO4，KH2PO4，K2HPO4，F(xiàn)eSO4，NaOH，Na2CO3，三氯乙酸，NaH2PO4，Na2HPO4，CuSO4，MnSO4，NaCl，ZnSO4，福林酚：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基及其制作

1.2.1 菌種保藏培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。

1.2.2 酪素篩選培養(yǎng)基

干酪素4 g，KH2PO40.3 g，NaNO32 g, K2HPO41 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20～25 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.2.3 麩皮培養(yǎng)基

250 mL的三角瓶，裝料量為麩皮 12 g、黃豆粉3 g、水15 mL，pH自然，121℃滅菌30 min。

1.3 主要儀器和設備

JA1003型電子天平 上海上天精密儀器有限公司；HI8424NEW型高精度酸度計 北京市哈納科技有限公司；SW-CJ-ZFD型超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；PYX-DHS-50X6.5-S型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；TG-16W型微量高速離心機 長沙湘儀離心機有限公司；THZ-320型臺式恒溫振蕩器 上海精宏試驗設備有限公司；WFZ UV-2800AH型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司；外徑千分尺 臺州市新上量量具有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種篩選

用無菌生理鹽水將醬醅稀釋成10-3～10-8濃度的菌液，采用稀釋平板涂抹法將其分別涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)72 h，挑取生長速度最快、產(chǎn)孢子量致密、表面顏色一致且個體形態(tài)無異的單個菌落移入PDA斜面培養(yǎng)基；用無菌生理鹽水將PDA斜面培養(yǎng)基上的孢子稀釋成10-3～10-8濃度的孢子懸浮液，并將其分別涂布于酪素平板培養(yǎng)基表面，置于28 ℃培養(yǎng)72 h，外徑千分尺測定每皿中透明圈直徑和菌落直徑(均以每皿中3個菌落的平均數(shù)計為該菌株的結(jié)果)，計算HE值[透明圈直徑(cm)/菌落直徑(cm)]。將HE較大的菌落轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)72 h待用。

1.4.2 誘變方法

用無菌生理鹽水將PDA斜面培養(yǎng)基的孢子稀釋成10-4，10-5，10-6個/mL的濃度，分別吸取100 μL 不同濃度的孢子懸浮液涂布于PDA培養(yǎng)基，取3個平板做對照不進行紫外誘變選用20 W紫外燈，25 cm處照射誘變，照射時間分別設計為1，3，5 min，照射后立即用錫箔紙進行避光處理，避免光修復。每個誘變處理做3個重復。在28 ℃培養(yǎng)72 h，計算致死率。再培養(yǎng)12 h計算HE值。

1.4.3 初篩方法

挑選紫外線誘變致死率在70%～80%的平板上的菌落，點種于干酪素篩選培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄透明圈直徑和菌落直徑，計算HE值。挑選HE值較大且孢子比較多的菌株移入PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)72 h，然后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 復篩方法

將經(jīng)過初篩后HE較大且孢子比較多的菌株接種于經(jīng)過滅菌冷卻到28 ℃的麩曲培養(yǎng)基中。接種量為4環(huán)，用接種鏟攪拌均勻，28 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)到48 h時，在無菌條件下?lián)u瓶1次。再繼續(xù)培養(yǎng)12 h后第2次搖瓶，接著培養(yǎng)12 h?？偣才囵B(yǎng)時間達到72 h后將三角瓶躺置12 h。最終培養(yǎng)時間達到72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，測定蛋白酶活力。

1.4.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

用誘變篩選出的突變株，分別在不同的溫度(28，30，32，34，36 ℃)、pH值(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5)、培養(yǎng)時間(40，44，48，52，56 h)下發(fā)酵，并測定其酶活力，考察溫度、pH值、培養(yǎng)時間對發(fā)酵的影響。

1.4.6 遺傳穩(wěn)定性試驗

將菌株每隔1個月轉(zhuǎn)接1次斜面，連續(xù)傳代6代，測定菌株發(fā)酵48 h后的產(chǎn)酶活性。每個菌株做3個重復，結(jié)果取平均值，比較其產(chǎn)酶活性變化，考察菌種的遺傳穩(wěn)定性。

1.4.7 酸性蛋白酶酶學性質(zhì)研究

1.4.7.1 粗酶液的制備

稱取55 ℃，10 h烘干的麩曲，加入pH 3.0的酸性緩沖液200 mL。在40 ℃水浴中浸出30 min，用新的定性濾紙過濾，濾液為酶浸出液。

1.4.7.2 單因素試驗對酶活性的優(yōu)化

酸性蛋白酶最適反應溫度：通過恒溫水浴鍋將反應溫度分別調(diào)到30，35，40，45，50，55 ℃，以pH 3.0的1.0%酪蛋白溶液為底物測定酶活力。

酸性蛋白酶最適反應pH：用0.1 mol/L乳酸和 0.2 mol/L乳酸鈉緩沖溶液配制pH值分別為4.5，4.0，3.5，3.0，2.5的1.0%的酪蛋白溶液，以此為底物測定酶活力。

金屬離子對酶活性的影響：分別用FeCl3，MgSO4，KCl，CuSO4，MnSO4，NaCl，ZnSO4溶液稀釋抽提初酶液，使酶液中最終金屬離子濃度為5 mmol/L，進行酶活測定，考察金屬離子(Fe3+，Mg2+，K+，Cu2+，Mn2+，Na+，Zn2+)對酶活力的影響。

1.4.7.3 正交試驗對酶活性的優(yōu)化

在單因素的基礎上，選出對酶活力影響較大的3個因素，每個因素設定3個水平，以酶活力作為評價指標，采用L9(34)正交表對酶活力影響條件進行優(yōu)化試驗。

1.4.7.4 熱穩(wěn)定性研究

在80 ℃的恒溫干燥箱中分別將抽提初酶液保溫1，2，3，5，10 min，迅速取出后立即放入冰水中，再用1.4.8項下酶活力測定方法測定酶活力。

1.4.8 酶活力測定

酸性蛋白酶活力的測定采用Folin-酚法(GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》)。酶活單位[30]：以酪蛋白為底物，在一定條件下1 min水解酪素，產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量定量為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5對結(jié)果進行分析，試驗重復3次，數(shù)值以平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

2.1.1 菌種的篩選

將分離純化的具有酪素水解能力的菌株稀釋成10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8(依次編號為①，②，③，④，⑤，⑥)，并且涂布到PDA平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h后，通過測定其菌落直徑和透明的水解圈直徑，計算其HE值，結(jié)果見表1。

表1 蛋白酶產(chǎn)生菌的初步篩選Table 1 Preliminary screening of protease producing bacteria

注：表中數(shù)據(jù)為3次測得的平均值。

由表1可知，菌株④的HE值最大，將其命名為JL-335。HE值大的菌株產(chǎn)酶能力強的幾率較高，所以選取菌株JL-335作為誘變出發(fā)菌株，進行紫外照射誘變。

2.1.2 誘變條件的選擇

分別取100 μL 菌株JL-335 的10-4，10-5，10-6個/mL的孢子懸浮液涂布于PDA培養(yǎng)基，取3個平板做對照不進行紫外誘變。統(tǒng)計誘變前后的菌落數(shù)，并計算致死率，結(jié)果見表2。

表2 紫外線誘變致死情況Table 2 The results of UV mutagenic death

紫外線誘變時間越長，菌株的致死率越高，同時突變率也高。一般認為，當致死率為70%左右時得到的突變株能滿足篩選的需要。由表2可知，處理時間為3 min時，致死率為74.3%，符合紫外誘變要求。而稀釋倍數(shù)為10-5時，平板菌落數(shù)量比較合適挑選單菌落，誘變效果最佳，所以我們采用20 W 紫外燈照射，距離平板25 cm，照射時間3 min，稀釋倍數(shù)10-5為最佳誘變條件。

2.1.3 紫外誘變初篩

將誘變后挑選出的6株長勢好、直徑較大并且孢子數(shù)較多的菌落，統(tǒng)計菌落直徑和透明圈直徑，計算HE值，結(jié)果見表3。

表3 誘變株干酪素平板初篩結(jié)果Table 3 The result of mutagenesis strain casein plate preliminary screening

一般HE值越大，產(chǎn)蛋白酶能力越強，由表3可知，誘變后有5株的HE值較大(菌株1,2,4,5,6)，其中菌株2的HE值最大，其HE值為1.91；其次為菌株5，其HE值為1.90。初篩的結(jié)果可以初步鑒定出哪些菌株的蛋白酶活力較高，需要進一步測定蛋白酶活力才能確定菌株分解蛋白質(zhì)的能力。

2.1.4 紫外誘變復篩

將5株初篩的菌種分別接種到已滅菌的麩曲培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h。制備蛋白酶液，測定其蛋白酶活力，測定結(jié)果見圖1。

圖1 紫外誘變后各菌株酸性蛋白酶活力Fig.1 Acid protease activity of each strain after UV mutagenesis

注：*，p<0.05，和對照組比較。

由圖1可知，誘變后的5個突變株中，1,2,5,6號菌株的酶活力增長顯著，尤其是6號菌株的酶活力增長最為顯著，從最初的847.2 U/mL提高到3000.8 U/mL，提高率將近254.2%，將其命名為SKY-520，進一步對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并研究其所產(chǎn)酸性蛋白酶的性質(zhì)。

2.1.5 發(fā)酵因素考察

將菌株SKY-520分別在不同的溫度、pH值、培養(yǎng)時間下發(fā)酵，測定其酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2 不同培養(yǎng)溫度(A)、pH值(B)、培養(yǎng)時間(C)下的酶活力Fig.2 Enzyme activity of different culture temperatures(A)， pH values(B)，culture time(C)

由圖2中A可知，培養(yǎng)溫度為28 ℃時，酶活最高，隨著溫度的升高，酶活力越來越低，低溫有利于酶的積累，因此選用28 ℃作為發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度。由圖2中B可知，發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH為5.0，pH低于5.0或高于5.0，酶活都降低。由圖2中C可知，培養(yǎng)時間為48 h時，酶活最高，因此選用培養(yǎng)時間為48 h作為發(fā)酵產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)時間。

2.1.6 遺傳穩(wěn)定性考察

將誘變菌株中酸性蛋白酶活力最高且增長率較高的菌株SKY-520接種于PDA斜面培養(yǎng)基中進行傳代，每隔1個月轉(zhuǎn)接1次斜面，連續(xù)6次繼代培養(yǎng)，并且分別測定其培養(yǎng)種曲的蛋白酶活力，檢測該突變株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 SKY-520的遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Results for genetic stability of SKY-520

由表4可知，SKY-520的酸性蛋白酶活力波動范圍不大，波動范圍在(2905.0±12.5)～(3000.8±16.1) U/mL之間，說明該菌株的遺傳穩(wěn)定性好。將菌株SKY-520接種在PDA斜面培養(yǎng)基在28 ℃培養(yǎng)48 h，4℃冰箱保藏備用。

2.2 高活性酸性蛋白酶酶學性質(zhì)研究

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

將發(fā)酵得到的酸性蛋白酶液體分別在不同的溫度、pH值、金屬離子下以1.0%酪蛋白溶液為底物測定酶活力，考察各因素對酶活力的影響，見圖3。

圖3 不同溫度(A)、pH值(B)、金屬離子(C)對酶促反應的影響Fig.3 The effects of different temperatures(A)，pH values (B)，metal ions (C) on enzymatic reaction

注：*，p<0.05，和對照組比較。

由圖3中A可知，酶在不同溫度下表現(xiàn)出來的酶活力有很大差異，其適宜的酶促反應溫度在40～50 ℃之間，在 45 ℃時最高。酶促反應受溫度的影響主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面是當溫度升高時，反應速率加快；另一方面是由于隨著溫度的升高使酶蛋白逐漸變性而失去活性，引起酶反應速率下降。溫度的這兩種影響綜合產(chǎn)生酶反應的“最適溫度”。酶在一定條件下都有其特定的最適pH，但是酶的最適pH受許多因素的影響，隨著底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度的不同而改變，因此最適pH也只有在一定條件下才有意義，由圖3中B可知，pH過高或過低時均影響酶活力。在pH為3.5時，酶活力最高，證明該酶的最適反應pH值是3.5。另外，酶促反應受多種金屬離子的調(diào)節(jié)，其對酸性蛋白酶活力影響較大。由圖3中C可知，Mn2+和Cu2+對酸性蛋白酶具有強烈的激活作用，分別達到對照酶活的175.3%和144.3%，而Fe3+，Mg2+，K+等金屬離子對酶的抑制作用明顯。這個結(jié)果和眾多文獻報道的Mn2+離子對該酶有強烈的激活作用，同時較低濃度Cu2+也有輕度的激活作用的結(jié)果相一致。

2.2.2 正交試驗結(jié)果

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取溫度(A)、金屬離子(B)和pH值(C)3個因素進行正交試驗(見表5)，結(jié)果見表6。

表5 L9 (34)正交試驗因素水平表Table 5 Factors and levels of orthogonal experiment L9(34)

表6 正交試驗結(jié)果表Table 6 The results of orthogonal experiment

根據(jù)極差大小可知，影響酸性蛋白酶活性的各因素大小依次為：金屬離子、pH值和溫度。最佳酶促反應組合為 A2B1C2，即45 ℃、pH 3.5、金屬離子Mn2+。在此條件下，酶活力可以提高到183.7%。

2.2.3 熱穩(wěn)定性研究

經(jīng)過不同時間的干熱處理后，酸性蛋白酶的熱穩(wěn)定性見表7。

表7 酸性蛋白酶的熱穩(wěn)定性研究Table 7 Study on thermal stability of acid protease

在80 ℃下，隨著處理時間的延長酶活下降，保溫10 min 仍保留有74.2%的酶活。結(jié)果顯示酸性蛋白酶具有很好的抗高溫性能。

3 討論

酸性蛋白酶是一種非常重要的工業(yè)酶制劑，在釀酒、調(diào)味品釀造、輕工、皮革和飼料行業(yè)都具有廣泛的應用，每年的用量很大。菌種的性能對其產(chǎn)量起決定作用，因此選育誘變高活力產(chǎn)酶菌株是關鍵問題之一[28]。紫外線是非常有效的菌株誘變技術，已廣泛用于微生物菌種的誘變選育[29，30]。

我們首先利用建洛生物公司提供的醬醅，采用平板透明圈法，選擇HE值(透明圈直徑/菌落直徑)較大的菌株JL-335作為誘變出發(fā)菌株，將稀釋成不同濃度，并接種在PDA培養(yǎng)基，采用20 W紫外燈，距離25 cm，照射時間3 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)10-5時的HE最大。將其結(jié)合產(chǎn)酸性蛋白酶活力大小等為評價標準，篩選出一株酸性蛋白酶活力高菌株SKY-520，其產(chǎn)酶能力從最初的847.2 U/mL提高到3000.8 U/mL，提高率將近254.2%，相對于對照菌的酶活力提高具有顯著性。將誘變菌株SKY-520在不同溫度、pH值、培養(yǎng)時間等因素下試驗，得出最佳發(fā)酵條件為溫度28 ℃、pH 5.0、培養(yǎng)時間48 h。篩選到的這株菌株，其產(chǎn)酶酶活得到了大幅度的提高，為工業(yè)生產(chǎn)選育了1株高產(chǎn)菌株。

對于一株菌株，必須遺傳性狀穩(wěn)定才能在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用。我們對篩選得到的高產(chǎn)酶菌株SKY-520，每隔1個月轉(zhuǎn)接1次斜面，連續(xù)6次繼代培養(yǎng)結(jié)果表明該菌株的遺傳性狀穩(wěn)定。

我們將得到的菌株所產(chǎn)的酸性蛋白酶進行了酶學性質(zhì)的研究，本研究通過單因素和正交試驗分別考察了溫度、pH值以及金屬離子等對酸性蛋白酶酶促反應的影響，最終確定該酶的最適作用條件為45 ℃、pH 3.5、金屬離子Mn2+，此時酶活性可以提高183.7%。另外，酸性蛋白酶在使用過程中存在酶活性損失嚴重的問題，限制了其使用，我們考察了該酶的熱穩(wěn)定性。我們對該酶在80 ℃下，采用不同時間的干熱處理后發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間的延長酶活下降，在80 ℃恒溫干燥箱中保溫10 min仍保留有74.2%的相對酶活，說明該酶具有較好的抗高溫能力。這些研究結(jié)果對于該酶越來越廣泛的使用以及使用中條件的選擇具有很好的指導意義。

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