張夢瑤，巨安慶，楊 峰，劉開東，王國義，柳 楠，賀建寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島 266121；3.赤峰市敖漢旗種羊場，內(nèi)蒙古赤峰 024300）

大多數(shù)綿羊表現(xiàn)為季節(jié)性發(fā)情，通常在光照逐漸縮短的夏末秋初發(fā)情。哺乳動物的發(fā)情是一個多級的生理過程，包括發(fā)情初期的卵泡生長、卵母細胞減數(shù)分裂及卵泡破裂黃體化。目前關(guān)于家畜季節(jié)性發(fā)情的啟動機制研究較少，大多數(shù)集中在激素水平的變化，如垂體分泌的促性腺激素、促卵泡激素及促黃體激素[1]等，而基因作用機制尚不清楚。因此尋找綿羊季節(jié)性發(fā)情的調(diào)控基因，對于提高綿羊的繁殖效率促進育種進程有重要意義。

促凋亡基因BAD屬于Bcl-2大家族[2]。細胞凋亡是受Bcl-2家族中促進和抑制細胞2類蛋白的比例決定，Bcl-2家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白通過競爭性作用來調(diào)控細胞凋亡，Bcl-2家族包括凋亡抑制基因bcl-2、mcy-1、bcl-xl等，凋亡基因BAD、bcl-xs、bax等和僅存在BH-3結(jié)構(gòu)域的基因bim、bik、bid等[3-4]。大量研究表明[5-6]，Bcl-2家族基因的表達產(chǎn)物也在線粒體調(diào)節(jié)的凋亡過程中起到關(guān)鍵性的作用。Zong等[7]和李東侃等[8]發(fā)現(xiàn)，BAD基因在眼球萎縮眼視神經(jīng)殘存髓鞘組織以及正常的視神經(jīng)髓鞘組織有表達，而在束間隔及神經(jīng)膠質(zhì)細胞不表達，表明BAD可能具有促進外傷性眼球萎縮的功能。RangEr等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺少BAD蛋白的小鼠會發(fā)生腫瘤細胞的增殖，而且絕大多數(shù)為B淋巴細胞瘤，這說明BAD是一種抑制腫瘤細胞的蛋白。

敖漢細毛羊是內(nèi)蒙優(yōu)良肉毛兼用型綿羊品種，表現(xiàn)為季節(jié)性發(fā)情，在夏末秋初開始發(fā)情[10]。本研究擬利用RT-PCR技術(shù)檢測BAD基因在乏情期、發(fā)情前期、發(fā)情間期以及發(fā)情期卵巢中BAD基因的表達情況，利用放射免疫方法測定了血液中促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）和孕激素（P4）的濃度，分析其與敖漢細毛羊季節(jié)性發(fā)情啟動的關(guān)系，為深入研究綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)理機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇飼養(yǎng)條件一致、體重接近、3～4周歲、空懷的健康敖漢細毛羊母羊24只，分為乏情期、發(fā)情間期、發(fā)情前期和發(fā)情期4組，每組6只羊。每只羊以發(fā)情開始到第2次發(fā)情開始作為其發(fā)情周期，分別在夏季的乏情期和秋季的發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情間期4個時間點處死細毛羊，并在最短時間內(nèi)用專門處理過的、潔凈的手術(shù)器械采集卵巢組織，立即放入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗試劑及儀器 瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、DEPC、DAPI等均購自青島賽尚科貿(mào)有限公司；iTaq-Uniwersal SYBR Green SuPermix 5 mL（5×1mL Vials）購 自Bio-Rad公 司；Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、DNA Ladder 2000、Dream TaqTM Green PCR Master Mix2×均購自北京索萊寶科技有限公司。核酸蛋白分析儀購自德國EppEndorf公司；EDC-810PCR儀購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-11型電泳儀購自北京市六一儀器廠；Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.3 血清采集 在乏情季節(jié)血液采集17 d；在發(fā)情季節(jié)從第1次發(fā)情開始采集血液，直至下一次發(fā)情開始結(jié)束。在8:00和14:00各采集不抗凝血各1次，每次10 mL。采集后血液37℃ 靜置2 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清于干凈的1.5 mL離心管中，置于-20℃的冰箱保存，備用。送至青島擎科生物采用放射免疫法測定血清中的P4、E2、LH和FSH濃度。

1.4 卵巢中RNA的提取及cDNA的合成 選取乏情期和發(fā)情期卵巢組織樣品60 mg，加入1 mL的TRN-zol Roche試劑粉碎勻漿后抽提RNA。使用BioPhotometer型核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，將檢驗合格的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 引物設(shè)計及合成 根據(jù)綿羊BAD基因（GenBank登錄號：XM-004019650.3）和綿羊GAPDH（GenBank登錄號：NM-001190390）的序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由青島擎科生物有限公司合成，引物的基本信息見表1。

1.6 實時熒光定量PCR 以cDNA為模板進行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板cDNA 1 μL，金牌Green mix 22 μL，上、下游引物各 1 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用2-△△CT值法計算各樣本中BAD相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達量。

1.7 統(tǒng)計分析 利用SPSS 17.0軟件中t檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增 1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示，引物擴增的條帶單一，內(nèi)參基因產(chǎn)物大小為125 bp ，目的基因產(chǎn)物大小為257 bp，與已知的目的基因大小一致，可用于后續(xù)實驗。

圖1 GAPDH（A）和BAD（B）擴增

2.2 實時熒光定量PCR結(jié)果 由圖2可知，BAD和GAPDH基因熔解曲線峰值單一、無雜峰，可知引物設(shè)計特異性良好，可用于下一步實驗。

圖2 BAD基因和GAPDH基因熒光定量擴增曲線（A）和熔解曲線（B）

2.3BAD基因的相對表達量 如圖3所示，BAD基因在發(fā)情前期的表達量極顯著高于乏情期、發(fā)情期和發(fā)情間期（P＜0.01）；在發(fā)情期的表達量極顯著高于乏情期和發(fā)情間期（P＜0.01）；乏情期和發(fā)情間期的表達量基本相同（P＞0.05）。

2.4 4種生殖激素在發(fā)情周期中的變化規(guī)律 由表2可知，E2濃度在第1、2 、16、17天 極顯著高于其他時間（P＜0.01），LH濃度在第1 天和第17 天極顯著高于其他時間（P＜0.01）；P4濃度在發(fā)情間期處于較高的水平，第5～15天濃度極顯著高于其他時間（P＜0.01），P4濃度在發(fā)情期處于發(fā)情季節(jié)的最低值；FSH濃度在發(fā)情后降低，在發(fā)情間期逐漸升高，在第5～13天濃度極顯著高于其他時間（P＜0.01），在發(fā)情期時處于較高的水平。

圖3 各個時期BAD基因的相對表達量

2.5BAD基因在不同發(fā)情時期的表達量與4種激素濃度變化的分析 由圖4可知，E2含量隨著BAD基因表達量的升高而升高，推斷BAD基因?qū)2的分泌均有促進作用。由圖5可知，LH的含量隨著BAD基因表達量的升高而升高，推斷BAD基因?qū)H的分泌均有促進作用。由圖6可知，P4濃度含量隨著BAD基因表達量的升高而降低，從而推斷BAD基因在發(fā)情季節(jié)的表達對P4分泌有抑制作用。由圖7可知，F(xiàn)SH的濃度變化沒有相應(yīng)的促進和抑制規(guī)律變化關(guān)系，從而推斷BAD基因的表達與FSH濃度的變化沒有相應(yīng)關(guān)系。

圖4 E2濃度與BAD基因相對表達量

3 討 論

BAD基因是與卵泡閉鎖相關(guān)的促凋亡因子。王龍濤等[11]對BAD基因在小尾寒羊和薩?？搜蚵殉病⑤斅压芎妥訉m中的定位進行研究發(fā)現(xiàn)，BAD基因在原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡呈現(xiàn)中度著染，而在3級卵泡中呈輕度著染；在小尾寒羊和薩?？搜蚵雅萜谥蠦AD基因在卵巢卵泡、輸卵管以及子宮內(nèi)膜細胞中均有不同程度的表達，提示BAD基因的表達參與母羊生殖器官細胞凋亡的調(diào)控。BAD基因在小尾寒羊和薩?？搜蛏称鞴僦斜磉_有顯著的差異[12]，提示BAD基因在母羊生殖器官中的表達對于調(diào)控生殖器官細胞凋亡以及對母羊繁殖力有某種程度的影響，但具體調(diào)控機制有待進一步研究。本研究結(jié)果顯示，BAD基因在發(fā)情前期的表達量極顯著高于其他3個時期，這與前期相關(guān)研究結(jié)果一致，另一方面推測出BAD基因是與卵泡閉鎖相關(guān)的促凋亡因子。

表2 敖漢細毛羊發(fā)情周期4種激素濃度

圖5 LH濃度與BAD基因相對表達量

圖6 P4濃度與BAD基因相對表達量

圖7 FSH濃度與BAD基因相對表達量

綿羊的發(fā)情周期一般為16.5（14～20）d，本實驗中的敖漢細毛羊發(fā)情周期為17 d。在發(fā)情前期，由于受FSH影響，卵泡開始明顯生長，產(chǎn)生的E2增加，使得輸卵管內(nèi)膜細胞生長及其微絨毛增長，黏膜慢慢變厚。本研究中E2濃度在第1 天和第2 天的濃度顯著高于其他時間段，與理論相符合，主要在動物的初情期前促進第二性征發(fā)育和垂體以及下丘腦有關(guān)生殖內(nèi)分泌的活動。LH對維持黃體功能具有重要作用，發(fā)情后期也叫后情期，發(fā)情期之后，動物在LH作用下黃體迅速地發(fā)育。LH與FSH都是由腺垂體分泌，同屬糖蛋白激素[13]，在FSH的協(xié)同作用下促進雌性動物的卵泡成熟和排卵，使得排卵后的顆?；毎S體化。在發(fā)情的第14天綿羊會進入卵泡期，這個時期FSH分泌激增，從而產(chǎn)生了排卵之前FSH高峰值，P4濃度會迅速下降，伴隨著黃體的逐漸退化，同時E2的濃度會伴隨著P4下降而快速升高，出現(xiàn)于LH峰平行的E2峰。本實驗數(shù)據(jù)顯示，LH濃度在發(fā)情前期和發(fā)情后期顯著高于其他時期，這與LH的生理功能作用相一致，在后期促進黃體的發(fā)育。同樣FSH在間期分泌增加協(xié)同LH來促進卵泡的成熟和排卵，在動物的發(fā)情中扮演著重要的角色。在發(fā)情周期中，P4的分泌量濃度變化與黃體的生長發(fā)育保持一致，在第8天的時候P4的分泌量達到最高水平，在發(fā)情前期開始下降。趙偉等[14]在對波爾山羊的研究中發(fā)現(xiàn)，P4在發(fā)情的第7天明顯上升，到達第11天的時達到最大值，之后分泌量逐漸降低。從整體上來看，綿羊在黃體期的外周血中P4濃度處于比較高的水平；本實驗數(shù)據(jù)顯示，P4在發(fā)情間期處于較高的水平，發(fā)情期濃度較低。

近期研究表明黃體的退化受細胞凋亡調(diào)控。盧璐璐等[15]通過沉默卵泡顆粒細胞中BAD基因，運用放射免疫法得到P4會隨著BAD基因的表達下降而極顯著升高，E2的分泌量也有所下降但差異不顯著。推測BAD基因可能通過調(diào)控P4的分泌量來控制綿羊的發(fā)情啟動和維持發(fā)情[16]。葛晨霞等[17]研究表明，黃體的退化可能需要BAD基因參與，BAD基因的表達可能受到P4濃度的影響。通過對小鼠輸卵管中BAD基因的研究發(fā)現(xiàn)，其在發(fā)情間期的表達呈上升趨勢，而在發(fā)情期則逐漸降低，會隨著發(fā)情不同階段的變化而變化，與動物的發(fā)情啟動密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，P4在發(fā)情間期保持較高濃度，后隨著BAD基因表達量的升高而顯著降低。E2的分泌量隨著BAD基因表達量的升高而升高，本實驗與相關(guān)報道一致，從而推出BAD基因的表達對E2、P4的分泌有相應(yīng)的促進和抑制作用。

本實驗熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情前期BAD基因的表達量極顯著高于乏情期、發(fā)情期和發(fā)情間期；發(fā)情期的表達量極顯著高于乏情期和發(fā)情間期；乏情期和發(fā)情間期的表達量基本相同，沒有顯著性差異。在沉默卵泡顆粒細胞中BAD基因的情況下，運用放射免疫法得到結(jié)果顯示，P4會隨著BAD基因的表達下降而極顯著升高；E2的分泌量也有所升高但是差異不顯著，反向驗證了BAD基因抑制P4的表達[14]。P4的結(jié)果與本實驗結(jié)果相一致，P4會隨著BAD基因的表達升高而極顯著降低。但本實驗中E2的分泌量也隨著BAD基因的表達升高而顯著升高，這可能與實驗動物的品種差異有關(guān)；FSH濃度與BAD基因的表達沒有直接的相關(guān)性。綜上結(jié)果表明，BAD基因的表達對卵巢的成熟起到了一定的促進作用，同時也影響了生殖激素的分泌，從而得出基因的表達對綿羊的發(fā)情有一定的控制作用。

4 結(jié) 論

BAD基因在發(fā)情前期的表達量極顯著高于其他時期；E2和LH濃度在BAD基因表達量最高的發(fā)情前期維持在較高水平，P4的濃度維持較低水平，推斷BAD基因的表達對卵泡的成熟起促進作用，同時也促進了E2和LH的分泌，抑制了P4的產(chǎn)生，進而影響細毛羊發(fā)情。

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