柳淑云 常學(xué)鋒 劉旭光

(北京市昌平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科，北京 102208)

急性心肌梗死(AMI)是急性危重癥疾病。心肌細(xì)胞減少和缺血缺氧是導(dǎo)致心肌梗死晚期出現(xiàn)難治性心力衰竭等癥狀的主要因素。因此，增加有活性的心肌細(xì)胞數(shù)量是病因上治療心肌梗死的關(guān)鍵。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)能夠分化為心肌組織和血管，減輕心室重構(gòu)〔1〕。而且，最近的臨床試驗表明，移植的異體BMSCs與自體BMSCs同樣可以安全有效地用于心肌細(xì)胞再生〔2〕。因此，BMSCs的移植為AMI的治療提供了希望。

1 材料和方法

1.1試劑 DAB顯色酶底物試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。 小鼠單克隆抗BrdU抗體購自上海浩然生物技術(shù)有限公司。 L-DMEM培養(yǎng)基購自北京雅安達生物技術(shù)有限公司；Percoll分離液(1.073 g/ml)、CD34和CD44兔單克隆抗體、2.5 mm×15 mm OTW球囊，購自美國Gibco公司。

1.2動物 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心獲得24只健康比格犬，雌雄各半，體重16.0～17.5 kg。

1.3BMSCs 準(zhǔn)備 取骨髓：將犬以5%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉后，用20 ml注射器穿刺抽取犬肱骨骨髓10 ml，加入等體積肝素。離心純化BMSCs，獲得的單核細(xì)胞在直徑100 mm的培養(yǎng)皿中接種，培養(yǎng)液內(nèi)含20%磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的L-DMEM。在37.0℃，5%CO2下培養(yǎng)。 過24 h更換培養(yǎng)基。細(xì)胞生長至68%以上時，細(xì)胞以1∶3的比例傳代，48 h更換一次培養(yǎng)基。 用第三代細(xì)胞進行測定，MTT比色檢測培養(yǎng)細(xì)胞的生長規(guī)律。通過CD34和CD44陽性細(xì)胞的免疫組化染色鑒定BMSCs。在移植前24 h，加入10 μl BrdU標(biāo)記液以標(biāo)記BMSCs。

1.4犬AMI模型的制作 禁食8 h后，3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉實驗動物。以Sedinger技術(shù)穿刺右側(cè)股動脈，置入6 F鞘管。將6 F導(dǎo)管(造影)，自犬右股動脈置入至主動脈根部，注入適量造影劑優(yōu)維顯，顯示左冠狀動脈前降支(LAD)。用BMW導(dǎo)絲推送6F OTW球囊導(dǎo)管至LAD遠(yuǎn)端，使之達第一間隔支和第二間隔支之間，抽除導(dǎo)絲，注入適量造影劑優(yōu)維顯，以4～6 amt充盈球囊堵塞LAD 4 h后撤除氣囊，造模完畢。

1.5分組 模型成功7 d后，將狗隨機分為4組，每組6只，雌雄各半。(1)PBS組：5 ml生理鹽水沖洗后，用OTW球囊將LAD開口完全堵塞，然后自中心腔由遠(yuǎn)及近于2 min內(nèi)注射PBS。(2)微泡+PBS組：LAD開口，給予超聲輻射：經(jīng)股靜脈應(yīng)用微量泵以1.5 ml/min勻速緩慢靜脈注射2.0 ml聲諾維，同時啟動超聲。超聲探頭固定于犬心臟左室乳頭肌水平，觀看短軸切面圖；時間觸發(fā)模式，觸發(fā)脈沖持續(xù)時間2 ms，幀頻(FPS)為0.48，觸發(fā)時間間隔2 s，機械指數(shù)(MI)1.33，作用時間11 min，深度9～10 cm，強度為1.1 W/cm2，頻率為1.2 MHz，其后操作同PBS組。(3)BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同PBS組。(4)微泡+BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同微泡+PBS組。

1.6觀察指標(biāo) (1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長特性、數(shù)目及鑒定；(2)BMSCs的體外免疫組化標(biāo)記；(3)造模時在指引導(dǎo)管內(nèi)通過注入適量造影劑，查看其在氣囊近端是否受阻，以清楚血流有無阻斷情況；(4)M型超聲、二維超聲心動圖及心肌聲學(xué)造影(MCE)測量心功能、灌注缺損面積占左室總灌注面積的百分比(DA)：MCE測量DA；M型超聲測量心功能，包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)、室壁增厚率(D)、短軸縮短率(FS)、室壁運動異常指數(shù)(WMSI)。造模前及造模后4 h、梗死相關(guān)冠狀動脈再通后，分別進行心肌造影。選擇每次造影心肌顯影達平臺時灌注缺損面積最小的圖像，應(yīng)用Matlab軟件計算DA%。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，多組計量資料比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長特性、數(shù)目及鑒定 原代培養(yǎng)BMSCs約12 h貼壁，一般3～4 d可以傳代一次。第2代細(xì)胞形態(tài)以長梭形為主；傳代后呈漩渦生長(圖1)。MTT細(xì)胞生長曲線分析，培養(yǎng)第1、2、3代細(xì)胞的生長規(guī)律基本一致，首先經(jīng)過1～2 d滯留期，第3天開始進入對數(shù)生長期，第7天達到平臺期，此時細(xì)胞數(shù)目不再增加(圖2)，可行傳代。1 w后獲得BMSCs數(shù)量為1×107個，3 w后傳代2次，從第3代細(xì)胞中可以獲得足夠數(shù)量的BMSCs：107個/盤，共24盤。

圖1 第3代細(xì)胞(×100)

圖2 MTT分析各代培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線

2.2培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定 CD34、CD44免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示表面抗原CD34呈陰性表達，CD44呈陽性表達(圖3)，這是BMSCs的特異標(biāo)志。

2.3BMSCs的體外免疫組化標(biāo)記 在BrdU 摻入BMSCs 24 h后進行免疫組化染色，細(xì)胞核染為棕褐色，證明 BrdU 已經(jīng)摻入細(xì)胞核中(圖4)。

2.4造模成功 冠狀動脈造影顯示LAD動脈閉塞。阻塞部位為第一、二間隔支之間，其遠(yuǎn)端再無造影劑顯示，血流中斷，證實AMI模型建立成功(圖5)。MCE同步心電圖導(dǎo)聯(lián)V1表現(xiàn)出特征性AMI變化，包括弓背向上抬高的ST段與直立的T波連接以形成單個曲線和病理Q波(圖6)。

2.5心功能和DA%的測量 各組造模后4 h心臟功能顯著降低，DA%顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測BMSCs的表面抗原(DAB染色，×200)

圖4 BMSCs的體外免疫組化染色(DAB染色，×200)

圖5 封堵前降支

圖6 特征性AMI變化

表1 各組EDV、LVEF、FS、D、WMSI和DA測量結(jié)果

與造模前比較：1)P<0.05

3 討 論

通常AMI治療包括藥物治療和手術(shù)治療，主要手術(shù)方法包括冠狀動脈內(nèi)植入支架和冠狀動脈旁路移植術(shù)植入。盡管這些治療方法在挽救和改善患者生活質(zhì)量方面取得了成功，但沒有取代梗死區(qū)丟失的組織，即沒有從根本上解決問題。由于心臟的再生能力很低，需要新的治療方法，以便在細(xì)胞和分子水平上培育新的組織并治愈心臟〔3〕。

將足夠的BMSCs安全、準(zhǔn)確地歸巢到梗死區(qū)是從根本上治療AMI的關(guān)鍵。通過同軸整體交換型OTW導(dǎo)管經(jīng)梗死相關(guān)冠狀動脈移植的BMSCs不僅定位準(zhǔn)確，而且風(fēng)險較低，易于操作；診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞可以增加血管通透性，促進BMSCs歸巢到心肌梗死區(qū)〔4～6〕。為此，本文建立了犬AMI模型，驗證冠狀動脈內(nèi)移植和超聲介導(dǎo)的微泡破壞的組合是否可以促進BMSCs準(zhǔn)確和有效率地移植到梗死區(qū)。

本研究結(jié)果表明，BMSCs的移植促進BMSCs在心肌內(nèi)存活，提高α-肌動蛋白表達，增加了能夠有效收縮的心肌細(xì)胞數(shù)量，減少了心肌梗死面積和灌注缺陷面積，心臟功能得到了有效改善。

心肌梗死發(fā)生后病變局部的微環(huán)境是細(xì)胞存活的最關(guān)鍵因素，他將影響移植細(xì)胞的黏附，遷移和定植能力及長期存活〔7〕。因此選擇合適的移植時機非常重要。Gehrke等〔8〕發(fā)現(xiàn)在心肌梗死后第7天，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌達到高峰，可能此時為移植細(xì)胞提供最充分的血供，且在心肌梗死7～15 d，纖維組織開始生成，炎癥反應(yīng)較前減弱，可能此時對心肌的損害降至最低，此時移植細(xì)胞容易存活。

本研究結(jié)果也證實了BMSCs移植后能夠存活和分化，這為心肌梗死的干細(xì)胞臨床治療提供了借鑒。

1Du M,Schmull S,Zhang W,etal.C-kit(+)AT2R(+) bone marrow mononuclear cell subset is a superior subset for cardiac protection after myocardial infarction〔J〕.Stem Cells Int,2016;2016:4913515.

2Hare JM,Fishman JE,Gorstenblith G,etal.Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy〔J〕.JAMA,2012;308:2369-79.

3Lister Z,Rayner KJ,Suuronen EJ.How biomaterials can influence various cell types in the repair and regeneration of the heart after myocardial infarction〔J〕.Front Bioeng Biotechnol,2016;4(1):62.

4Fakoya AD.New delivery systems of stem cells for vascular regeneration in ischemia〔J〕.Front Cardiovasc Med,2017;4(1):7.

5Liao YY,Chen ZY,Wang YX,etal.New progress in angiogenesis therapy of cardiovascular disease by ultrasound targeted microbubble destruction〔J〕.Biomed Res Int,2014;2014:872984.

6Yousef M,Schannwell CM,Kostering M,etal.The BALANCE Study:clinical benefit and long-term outcome after intracoronary autologous bone marrow cell transplantation in patients with acute myocardial infarction〔J〕.J Am Coll Cardiol,2009;53(24):2262.

7Wang J,de Veirman K,de Beule N,etal.The bone marrow microenvironment enhances multiple myeloma progression by exosome-mediated activation of myeloid-derived suppressor cells〔J〕.Oncotarget,2015;6(41):43992-4004.

8Gehrke I,Gandhirajan RK,Poll-Wolbeck SJ,etal.Bone marrow stromal cell-derived vascular endothelial growth factor (VEGF) rather than chronic lymphocytic leukemia (CLL) cell-derived VEGF is essential for the apoptotic resistance of cultured CLL cells〔J〕.Mol Med,2011;17(7-8):619-27.