洪芳滕龍何建成#

1 上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203

2 浙江醫(yī)院 浙江 杭州 310013

帕金森病（PD）是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，左旋多巴（L-dopa）是治療PD最有效的藥物，但長期應(yīng)用可引起諸多運動并發(fā)癥[1]，其中最突出的是左旋多巴誘導(dǎo)異動癥（LID）。復(fù)方地黃方是我們挖掘中醫(yī)藥理論并經(jīng)臨床證明治療PD及LID有效的中藥復(fù)方。帕金森病異動癥的發(fā)生發(fā)展與多巴胺D1、D2受體密切相關(guān)，而復(fù)方地黃方對LID有明顯的緩解作用[2-3]。本次實驗運用Western Blot方法研究了各組大鼠紋狀體多巴胺D1、D2受體的表達(dá)，并觀察了神經(jīng)行為學(xué)變化，以深入探討它們在LID狀態(tài)中的變化以及復(fù)方地黃方的影響。

1 材料和方法

1.1 動物：SD大鼠，100只，SPF級，雄性，體重180～200g，來源并飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SCXK（滬）2012-0002]，許可證號：[SYXK（滬）2014-0008]，自動光-暗控制（LD12∶12，即07：00～19：00光照，19：00～07：00暗置），相對濕度60%～65%，恒溫23±2℃，動物攝食飲水自由。

1.2 試劑：左旋多巴干粉（批號：192K1885），芐絲肼（批號：BCBB8323），6-羥基多巴胺（6-OHDA），阿撲嗎啡（APO），抗壞血酸，均為美國Sigma公司產(chǎn)品；兔源性D1抗體，兔源性D2抗體，均為美國Abcam公司產(chǎn)品；β-Actin，為美國CST公司產(chǎn)品；Marker，為美國Thermo公司產(chǎn)品；山羊抗兔二抗，Western及IP細(xì)胞裂解液，SDSPAGE凝膠配制試劑盒，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X），均為碧云天公司產(chǎn)品。

1.3 藥物：復(fù)方地黃方的組成包括熟地黃、白芍、珍珠母、丹參、全蝎等。湯藥按既定工藝煎煮，由上海雷允上藥材有限公司代加工，濃度為5.18g/ml。用量根據(jù)孫瑞元[4]標(biāo)準(zhǔn)體重大鼠每日用量方法計算。標(biāo)準(zhǔn)體重大鼠每日用量計算公式為DB=DA×KB/KA[DA：標(biāo)準(zhǔn)體重成人每日用量；KB：大鼠劑量折算系數(shù)（7）；KA：成人劑量折算系數(shù)（388）]。即大鼠每日用量DB＝DA×7/388。

1.4 儀器：大鼠腦立體定位儀（RWD-68003型），為深圳瑞沃德生命科技有限公司；WesternBlot電泳及轉(zhuǎn)膜裝置，為美國Bio-Rad公司；超速離心機（LE80K型），為Beckman公司產(chǎn)品。

1.5 LID大鼠模型制備：PD模型采用Ungerstedt[5]等所創(chuàng)立的經(jīng)典、公認(rèn)的方法。術(shù)前SD大鼠進(jìn)行常規(guī)行為測試，確認(rèn)無旋轉(zhuǎn)行為。3%戊巴比妥鈉（0.15ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀，頭部去毛，消毒后沿正中線切開顱頂皮膚，露出前囟。根據(jù)包新民[6]所著《大鼠腦立體定位圖譜》，定位右側(cè)黑質(zhì)二坐標(biāo)：①前囟后5.2mm，正中線右側(cè)1.0mm，硬膜下9.0mm；②前囟后5.2mm，正中線右側(cè)2.5mm，硬膜下8.5mm。顱骨鉆鉆孔后用5μl微量進(jìn)樣器將6-OHDA（濃度為2g/L，溶于含0.2%維生素C的生理鹽水）注入右側(cè)黑質(zhì)部，每孔3μl，注射速度為1μl/min，注射后留針5min，然后以1.0mm/min速度緩慢退針。術(shù)后縫合切口，肌肉注射慶大霉素，放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。正常對照組僅固定動物。假手術(shù)組僅注射等量的含0.2%維生素C生理鹽水。10d后，大鼠腹腔注射阿撲嗎啡（0.5mg/kg），記錄開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，旋轉(zhuǎn)頻率每分鐘平均超過7次者為合格的PD模型[7]。將造模成功的PD模型大鼠，進(jìn)一步腹腔注射L-dopa/芐絲肼治療（10mg/ml L-dopa和2.5mg/ml芐絲肼溶于含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸的生理鹽水中），L-dopa的注射劑量為50mg/kg加12.5mg/kg芐絲肼，每天2次進(jìn)行腹腔注射（9：00Am和5：00Pm），持續(xù)2周。正常對照組、假手術(shù)組腹腔注射等量的生理鹽水（含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸），每日2次，連續(xù)2周。2周后，APO誘導(dǎo)動物，具有典型異常不自主動作（AIM）表現(xiàn)（AIM評分大于20分），且對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加者，為陰虛動風(fēng)證LID模型大鼠[7]。

1.6 分組及給藥：分述如下。

1.6.1 分組方法：采用區(qū)層隨機法，將陰虛動風(fēng)證LID模型大鼠隨機分為4組：陰虛動風(fēng)證LID模型4周、6周組，復(fù)方地黃方4周、6周組，每組6只。另取正常對照4周、6周組，假手術(shù)4周、6周組，每組6只。

1.6.2 給藥方法：陰虛動風(fēng)證LID模型組大鼠繼續(xù)腹腔注射左旋多巴/芐絲肼（50mg/kg L-dopa和12.5mg/ml芐絲肼），生理鹽水灌胃；復(fù)方地黃方組大鼠腹腔注射L-dopa/芐絲肼，復(fù)方地黃方灌胃；正常對照組、假手術(shù)組腹腔注射等量的生理鹽水（含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸），生理鹽水灌胃。每鼠每次灌胃量為2ml，每日1次，分別連續(xù)用藥4周、6周。

1.6.3 樣本處理：①取大鼠紋狀體：在4周、6周不同時間點，每組大鼠進(jìn)行最后一次行為學(xué)檢測后，將各組大鼠以3%戊巴比妥（0.15ml/kg）腹腔注射麻醉，斷頭處死，快速開顱取腦，于冰上分離雙側(cè)紋狀體，置-80℃凍存。②實驗步驟：提取總蛋白，配制分離膠和堆積膠，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗體，顯影，分析。

1.7 觀察指標(biāo)：LID大鼠模型的行為學(xué)觀察，包括AIM評分、旋轉(zhuǎn)啟動時間、旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)；大鼠紋狀體多巴胺D1、D2受體的表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS16.0版軟件進(jìn)行齊性檢驗并作t檢驗和單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠AIM評分的變化：見表1。

表1 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠AIM評分的變化（±s，Scores/140min）

表1 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠AIM評分的變化（±s，Scores/140min）

注：與LID模型組比較，*P＜0.001；與成模期比較，#P＜0.01，##P＜0.001。

6周（n=6）0.00 0.00 45.67±3.27##24.33±5.20*#組別正常對照組假手術(shù)組LID模型組復(fù)方地黃方組成模期（n=12）0.00 0.00 31.00±5.31 31.75±6.66 4周（n=12）0.00 0.00 40.67±4.23##27.33±6.20*

2.2 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠旋轉(zhuǎn)啟動時間和持續(xù)時間的變化：見表2。

2.3 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及APO誘導(dǎo)后對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)變化：見表3。

表2 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠旋轉(zhuǎn)啟動時間和持續(xù)時間的變化（±s，s）

表2 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠旋轉(zhuǎn)啟動時間和持續(xù)時間的變化（±s，s）

注：與LID模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與成模期比較，#P＜0.001；與4周組比較，◆P＜0.01。

正常對照組假手術(shù)組LID模型組復(fù)方地黃方組0.00 0.00 233.83±21.23#124.33±16.48*#◆0.00 0.00 362.00±136.39 349.92±171.26 0.00 0.00 271.58±101.96 490.25±271.34**0.00 0.00 307.50±164.64 534.33±289.97*0.00 0.00 169.42±46.39 181.00±20.45 0.00 0.00 233.17±37.19#171.17±21.90*

表3 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及APO誘導(dǎo)后對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)變化（±s）

表3 復(fù)方地黃方干預(yù)后陰虛動風(fēng)證LID大鼠劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及APO誘導(dǎo)后對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)變化（±s）

注：與LID模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

正常對照組假手術(shù)組LID模型組復(fù)方地黃方組0.00 0.00 889.00±205.49 318.83±323.89**0.00 0.00 177.33±76.58 153.00±76.06 0.00 0.00 192.25±68.77 124.08±69.19*0.00 0.00 212.50±75.27 134.33±89.87 0.00 0.00 806.84±439.96 586.75±397.75 0.00 0.00 895.33±326.77 360.08±270.05***

2.4 各組大鼠紋狀體D1受體表達(dá)比較：LID模型組與正常對照組及假手術(shù)組比較，D1受體的表達(dá)上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；LID模型6周組與4周組比較，D1受體的表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。復(fù)方地黃方干預(yù)后，4周、6周組D1受體的表達(dá)均有下降趨勢，與LID組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001或P＜0.05）；復(fù)方地黃方6周與4周比較，D1受體的表達(dá)有下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表4、圖1。

表4 各組大鼠紋狀體D1受體表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠紋狀體D1受體表達(dá)比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.001；與假手術(shù)組比較，#P＜0.001；與LID模型組比較，★P＜0.001；與4周組比較，◆P＜0.001。

0.761±0.069 0.823±0.019 1.417±0.120**#◆1.108±0.087**#★◆正常對照組假手術(shù)組LID模型組復(fù)方地黃方組0.821±0.019 0.768±0.041 1.050±0.071**#0.912±0.045*#★

2.5 各組大鼠紋狀體D2受體表達(dá)比較：LID模型組與正常對照組、假手術(shù)組比較，D2受體的表達(dá)呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；LID模型組6周與4周比較，D2受體的表達(dá)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)復(fù)方地黃方干預(yù)后，4周、6周組D2受體的表達(dá)均有下降趨勢，與LID模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.001）。見表5、圖1。

表5 各組大鼠紋狀體D受體表達(dá)比較（±s）2

表5 各組大鼠紋狀體D受體表達(dá)比較（±s）2

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與假手術(shù)組比較，#P＜0.001；與LID模型組比較，★P＜0.001。

0.860±0.041 0.968±0.086 1.257±0.123***#1.020±0.141**★正常對照組假手術(shù)組LID模型組復(fù)方地黃湯組0.893±0.022 0.983±0.040 1.347±0.187***#1.027±0.041*★

圖1 各組大鼠紋狀體內(nèi)D1、D2受體表達(dá)量的變化

3 討論

本實驗運用WesternBlot方法研究了各組大鼠紋狀體多巴胺D1、D2受體的含量。實驗結(jié)果顯示，LID大鼠紋狀體中D1、D2受體的含量均增加。目前的研究證實，LID的發(fā)生與L-dopa的波動性刺激有關(guān)，半衰期僅為1.5h的外源性L-dopa引起一系列突觸后受體改變[8]。多巴胺D1受體的活化可使腺苷酸環(huán)化酶活力增強，催化ATP形成cAMP，激活了多種cAMP依賴的蛋白激酶。D2受體的生化機制與D1受體差異較大，激活D2受體可抑制或不影響腺苷酸環(huán)化酶的活力。雖然二者在生物化學(xué)活動方面具有較大差異，但在整體效應(yīng)中，卻表現(xiàn)出協(xié)同作用。本實驗中，D2受體在LID中含量增高，但6周組相較4周組呈下降趨勢，不排除隨著用藥時間的增加，D2受體含量繼續(xù)下降的可能。同時，筆者前期的研究顯示，D2受體在LID中親和力下降[9]。可見，使用L-dopa后，間接通路的活動增強不明顯，同時不排除逐漸下降的可能。

復(fù)方地黃方是筆者通過對大量中醫(yī)文獻(xiàn)和臨床經(jīng)驗的總結(jié)，并在臨床應(yīng)用治療LID取得滿意療效的中藥復(fù)方。其對帕金森病異動癥模型大鼠有明顯的抗氧化應(yīng)激、調(diào)控興奮性氨基酸、調(diào)控PPE、PDYN的作用。本實驗證明，LID大鼠經(jīng)復(fù)方地黃方干預(yù)后，神經(jīng)行為學(xué)有所改善，紋狀體D1、D2受體含量出現(xiàn)下調(diào)，AIM評分下降，劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，可見復(fù)方地黃方通過對D1、D2受體的調(diào)節(jié)，對直接通路和間接通路的失衡有一定的改善作用。綜上所述，筆者推測在LID的發(fā)生發(fā)展過程中，以直接通路的活動增強為主，直接通路的過度激活可致自主運動過多及動作過度。復(fù)方地黃方與L-dopa類藥物（美多巴）合用，有明顯的增效減毒作用。

[1]Zhang ZX，Roman GC，Hong Z，et al.Parkinson’s diseasein China：prevalence in Beijing，Xian，and Shanghai[J].Lancet，2005，365(9459)：595-597.

[2]滕龍，洪芳，何建成.中藥復(fù)方地黃方對帕金森異動癥模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)動態(tài)變化的研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2016，51（6）：411-413.

[3]張晨光，何建成.陰虛動風(fēng)證帕金森病LID大鼠氨基酸變化的動態(tài)研究及復(fù)方地黃方的干預(yù)作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2012，33(4)：501-506.

[4]孫瑞元.定量藥理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1987：247.

[5]Ungerstedt U.6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons[J].Eur J Pharmacol，1968，5(1)：107-110.

[6]包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：49-58.

[7]Carman LS，GagaFH，Shults CW.Partial lesion of the substantianigra：relation between extent of lesion and rotational behavior[J].Brain Res，1991，553(2)：275-283.

[8]Cenci MA，Ohlin KE，Rylander D.Plastic effects of L-DOPA treatment in the basal ganglia and their relevance to the development of dyskinesia[J].Parkinsonism Relat Disord，2009，15(3)：59-63.

[9]曹麗雙，何建成，莊燕鴻，等.不同中醫(yī)治法對帕金森病LD大鼠D2受體變化影響的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22(12)：3006-3008.