孟繁杰，羅麗雙，于月新，張寧，郝冬梅

（中國人民解放軍第202醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，沈陽 110003）

近幾年來，如何普及更精準(zhǔn)的產(chǎn)前篩查項目一直是優(yōu)生優(yōu)育要解決的關(guān)鍵問題，唐氏篩查準(zhǔn)確性低且伴有漏診，并不能成為可信度高的篩查手段。羊水培養(yǎng)雖作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但很多孕婦無法接受其有創(chuàng)性的采樣手段。孕婦血漿中存在胎兒游離DNA這一發(fā)現(xiàn)改變了這個局面［1-2］。隨著二代測序技術(shù)的迅速發(fā)展，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)對胎兒染色體非整倍體疾病13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征的檢測具有極高的準(zhǔn)確性［3-4］，不僅如此，近幾年的研究［5］發(fā)現(xiàn)其對性染色體的檢測也具有很高準(zhǔn)確性。本研究通過對2014年至2016年于中國人民解放軍第202醫(yī)院生殖中心就診的6 283例孕婦的血漿進(jìn)行高通量二代測序，同時對高?；颊哌M(jìn)行有創(chuàng)性介入診斷，明確了無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測對性染色體異常的篩查起到關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年12月至2016年12月間自愿在我院進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的6 283例孕婦，年齡16～51歲，平均年齡31.9歲，其中不愿意接受羊水穿刺的高齡孕婦 （＞35歲） 1 934例，低齡孕婦4 349例。平均孕周16.09周。

1.2 方法

1.2.1 DNA提?。翰裳?（EDTA抗凝） 采取5 mL孕婦外周靜脈全血，4 ℃、1 600 g離心10 min。取上清血漿，4 ℃、16 000 g再次離心10 min。按照核酸提取試劑盒操作說明書進(jìn)行血漿樣本中游離DNA的提取。

1.2.2 文庫構(gòu)建：將提取的DNA進(jìn)行末端修復(fù)，并用B1和B2磁珠對其進(jìn)行純化，連接接頭，PCR擴(kuò)增。

1.2.3 文庫定量：采用qPCR的方法對構(gòu)建完的文庫進(jìn)行DNA定量并分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 測序模板的制備：將文庫根據(jù)定量后的數(shù)據(jù)進(jìn)行混合，采用One Touch2對混合后的文庫進(jìn)行擴(kuò)增，最后用ES對模板序列進(jìn)行富集操作。

1.2.5 用BioelectronSeq 4000進(jìn)行上機(jī)測序：開啟氮氣瓶，用18 MΩ純水進(jìn)行儀器清洗；儀器初始化；設(shè)置Plan；準(zhǔn)備上機(jī)文庫；上機(jī)和測序。

1.2.6 測序數(shù)據(jù)分析：測序結(jié)束后，運用無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到樣本X染色體和Y染色體的Z值，根據(jù)每個樣本的Z值判斷樣本的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 無創(chuàng)產(chǎn)前基因染色體非整倍體檢測的人群分布

參加無創(chuàng)基因檢測的6 283例孕婦中，包含相當(dāng)一部分染色體非整倍體的高危人群。這些高危人群包括高齡孕婦（ 分娩時年齡≥35歲） ，占36%（ 2 262/6 283） ；血清學(xué)唐氏篩查結(jié)果顯示高危的孕婦，占7%（ 377/6 283） ；彩超顯示胎兒異常的孕婦，占2%（125/6 283） 。除此之外，還包括一些通過體外授精手段成功受孕的孕婦，占7%（ 440/6 283） ，其他占49%（3 079/6 283） 。

2.2 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測性染色體非整倍體

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的6 283例樣本中篩查出性染色體異常14例，篩查陽性率為0.22%。這14例陽性結(jié)果中包括6例XO高危、6例XXY高危和2例XXX高危。其中，1例XO高危、1例XXY高危和1例XXX高危孕婦拒絕進(jìn)一步診斷，對其余11例樣本進(jìn)行了核型分析。結(jié)果顯示：11例患者中，5例XO高危中2例被確診為胎兒性染色體異常 （其中1例確診為XO/XXX嵌合體，另外1例確診為XO） ，3例被確診為正常核型；5例XXY高危都被確診為XXY；1例XXX高危確診為XXX。本研究中無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測性染色體異常的準(zhǔn)確率為73% （8/11） 。見表1。

2.3 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測開展后我院性染色體異常檢出率的變化

2011年至2014年我院未開展無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測前，平均每年通過羊水培養(yǎng)性染色體異常胎兒的檢出率為0.8%，其中2011年為0.9% （2/229）， 2012年為1.1% （2/189）， 2013年為 0.7% （1/154）， 2014年為 0.6%（1/167）。2015年至2016年我院開展無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測后，平均每年性染色體異常胎兒的檢出率為4.3%，其中2015年為4.5% （5/112） ，2016年為4.1%（4/145） 。與2011年至2014年未開展無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測相比，2015年至2016年我院胎兒性染色體異常檢出率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2=11.394，P ＜ 0.05） 。

3 討論

胎兒游離DNA在母體外周血循環(huán)中的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著胎兒無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測領(lǐng)域的開端，并且使得無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測得以發(fā)展。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測作為一項通過分析孕婦外周血中游離DNA染色體數(shù)量的差異、對胎兒染色體非整倍體疾病21-三體綜合征 （唐氏綜合癥） 、18-三體綜合征 （愛德華氏綜合征） 、13-三體綜合征 （帕陶氏綜合征） 進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查項目，以其高靈敏性 （98.6%～100%） 和高特異性 （99.7%～100%） 而被廣泛用于臨床［6-10］。在我院參加無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的6 283例孕婦中發(fā)現(xiàn)，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測不只對這3對染色體有著很高的準(zhǔn)確性，對胎兒性染色體異常的檢測也有著很高的準(zhǔn)確性，并且在我院近2年的應(yīng)用中，對提高性染色體非整倍體異常的檢出率起到了很大的作用。

性染色體非整倍體異常主要包括Turner綜合征（45，XO） 、克氏綜合征 （47，XXY） 、超雌綜合征 （47，XXX） 、超雄綜合征 （47，XYY） 。這些疾病在胎兒生長發(fā)育過程中造成不同程度的影響，包括性器官發(fā)育不全，伴有智力、神經(jīng)功能障礙或其他臟器功能異常。其中，Turner綜合征在胎兒中的發(fā)病率約為1/2 500，并且有研究［11］表明首胎是Turner綜合征的母親再次懷孕時，胎兒為Turner綜合征的概率比一般人群高35倍，發(fā)病率為1.4%?？耸暇C合征在男嬰中的發(fā)病率約為0.23%［12］。這些性染色體異?？赡軐?dǎo)致胎兒性分化異常，從而導(dǎo)致其生殖器官發(fā)育不全、智力和生長發(fā)育障礙、智力低下、心腎發(fā)育異常等癥狀［13］。性染色體異常很少致死（除3個月內(nèi)自然流產(chǎn)）［14］，在B超下更是很難發(fā)現(xiàn)異常。羊水穿刺是診斷性染色體異常的有效手段，但由于其有創(chuàng)性，很少有孕婦會選擇這項檢查。近幾年來，雖然人們優(yōu)生意識有所提升，但每年在我院做診斷的總?cè)藬?shù)平均只有180人。這種低診斷率使得性染色體異常的胎兒很難被及時發(fā)現(xiàn)，錯過最佳的身體和心理治療時間，直到生育年齡才在不孕不育門診發(fā)現(xiàn)這一問題，我院每年都有一些因為性染色體異常導(dǎo)致不孕不育的夫妻前來就診。所以，對性染色體異常進(jìn)行無創(chuàng)篩查是臨床上需要的一種檢測［10］。我院開展無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測后，其不僅對胎兒染色體非整倍體疾病13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征的檢測有很高的準(zhǔn)確性和特異性，對性染色體異常檢測的準(zhǔn)確性也很高。而且，由于其無創(chuàng)的特點，大多孕婦可以接受這種檢測手段。近2年共有6 283例孕婦在我院接受這項檢測，其中36%為高齡人群，7%為人工授精受孕，這些孕婦很難接受羊水穿刺這種有創(chuàng)的檢測手段。在檢測到的14例無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測顯示性染色體異常的孕婦，仍有3例拒絕羊水穿刺診斷堅持分娩胎兒。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)雖然對于性染色體異常的檢測只是一種篩查手段，但由于其高準(zhǔn)確率的特點，可以提示孕婦在分娩之后注意觀察孩子的生長發(fā)育，盡早發(fā)現(xiàn)、診斷和治療患兒，在最佳階段對患兒進(jìn)行生長激素、性激素治療和心理輔導(dǎo)。

表1 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測性染色體異常結(jié)果Tab.1 Sex chromosome abnormalities detected by non-invasive prenatal genetic testing

我院從2014年12月開始開展無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測，在此之前，無胎兒性染色體異常的篩查方法，都是對一些高危人群通過羊水培養(yǎng)方法診斷出性染色體異常胎兒。2011年前，在我院做羊水穿刺的孕婦較少，并且無胎兒性染色體異常的孕婦做羊水培養(yǎng)。隨著對優(yōu)生優(yōu)育的重視，自2011年后進(jìn)行羊水培養(yǎng)的孕婦數(shù)量有所增加。在我院開展無創(chuàng)產(chǎn)前篩查這2年里，胎兒性染色體檢出率明顯提高，由2011年至2014年的平均0.8%升高至2015年至2016年的平均4.3%，說明無創(chuàng)產(chǎn)前篩查可以很有效的提高性染色體異常的檢出率。由此可見，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的開展對性染色體異常的檢出起到關(guān)鍵作用。

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