盧玉俊，趙信科，代晶晶

（甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管臨床醫(yī)學中心，蘭州 730000）

慢性心力衰竭 （chronic heart failure，CHF） 是多種心血管疾病的最終歸宿，整個過程伴隨著心室重構。心肌細胞外基質 （extracellular matrixc，ECM） 降解增加是心室重構的重要特征之一。降解ECM的基質金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases，MMP） 對于心室重構具有重要的影響，尤其是MMP-2在降解ECM的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用。金屬蛋白酶組織抑制劑1 （tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP-1） 能抑制MMP-2的活性，影響ECM的降解。B型腦鈉肽 （brain natriuretic peptide，BNP） 是心臟神經(jīng)內分泌激素，為臨床診斷CHF、判斷CHF嚴重程度的敏感指標。

中醫(yī)認為，陽氣虛衰、血瘀水停是CHF的基本病機，因此益氣溫陽、活血利水為治療心力衰竭的基本大法［1］。參桂保心方主要成分為太子參、桂枝、茯苓皮、白術、豬苓、澤瀉、紅花、丹參、葶藶子、大棗、麥冬和五味子。方中太子參補氣養(yǎng)陰，桂枝溫陽化氣行水，茯苓皮健脾滲濕利水，白術健脾助運燥濕，豬苓、澤瀉利尿消腫；紅花、丹參活血化瘀，葶藶子、大棗瀉肺平喘、利水消腫、強心，麥冬養(yǎng)陰潤肺，五味子斂肺補氣，全方具有益氣溫陽、活血利水之功效。研究［2］表明，參桂保心方可能具有減少MMP-2表達、降低BNP水平等作用。

本研究通過觀察參桂保心方對CHF大鼠MMP-2、TIMP-1、BNP水平及其對心臟組織病理學的影響，探討該藥對CHF大鼠心室重構的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物：10周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠（ 體質量180～220 g） 90只。由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供，合格證號為SCXK（ 甘） 2015-0002。

1.1.2 試劑：異丙基腎上腺素（ isoprenaline，ISO） 購自北京Solarbio公司，批號：20160722。

1.1.3 藥物：芪藶強心膠囊購自石家莊以嶺藥業(yè)公司，國藥準字Z20040141；參桂保心煎劑由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院煎藥中心提取制備。

1.2 動物分組、造模及給藥

90只大鼠適應性飼養(yǎng)半個月，隨機分為2組，實驗組75只，腹腔注射ISO 3 mg/ （kg·d） ，連續(xù)4周［3］；對照組15只，腹腔注射生理鹽水1 mL。4周后應用超聲心動圖 （ESAOTE彩超，意大利百勝公司） ，探頭頻率10 MHz，深度3 cm，測定值為5個心動周期的均值，檢測左室射血分數(shù)≤50%，認為CHF模型成功［4］，見圖1。將75只實驗組大鼠隨機分為模型組，芪藶強心組，參桂保心高、中、低劑量組，每組各15只。參桂保心組按高、中、低劑量 （相當于成人每kg體質量用量的24、12和6倍）［5］藥物灌胃，芪藶強心組以芪藶強心膠囊［0.42 g/ （kg·d） ］灌胃，對照組及模型組以等量生理鹽水灌胃，時間為8周。

1.3 心胸比率測定

12周后，將6組大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥置于Carestream多功能活體成像系統(tǒng)暗箱 （美國柯達公司） ，獲取大鼠胸部正位X線影像。測量心臟最大橫徑 （T1+T2） 、胸廓最大橫徑 （T） ，計算出心胸比率。心胸比率= （T1+T2） /T，正常值≤0.5。見圖2。

圖2 各組大鼠心胸比率Fig.2 Cardiothoracic ratio of the rats in each group

1.4 BNP測定

大鼠頸動脈取血3 mL，離心20 min （3 000 r/min） ，分離血清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 （大鼠腦鈉肽ELISA試劑盒，武漢基因美生物科技公司，批號JYM0445Ra） 測定大鼠血清BNP水平，嚴格按照說明書步驟操作。

1.5 心臟組織病理學檢查

在乳頭肌水平下方室間隔及左心室游離壁取心肌組織3塊，于10%甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水，包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察并進行病理學評分： （1） 心肌纖維有無肥大、變性、壞死； （2） 間質有無充血、水腫、炎癥細胞浸潤、結締組織增生； （3） 心內膜、心外膜有無充血、水腫、炎癥細胞浸潤。將上述病變由輕到重分別評分為1、2、3、4分，無病變?yōu)?分［6］，累加所有分數(shù)進行統(tǒng)計學處理。

1.6 免疫組化法檢測心肌MMP-2和TIMP-1表達

取包埋過的左心室中段心肌組織，用免疫組化法檢測MMP-2、TIMP-1。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書 （美國ImmunoWay公司，批號YT2798、YT4658）進行。胞膜、胞質有黃至棕黃色顆粒者為蛋白陽性細胞。取組化切片于光鏡下400倍放大，隨機選取5個視野，用多功能彩色圖像分析系統(tǒng)測量其灰度值，取平均值，灰度值越低表明濃度越高［7］。

1.7 Western blotting檢測心肌MMP-2和TIMP-1蛋白表達水平

稱取心肌組織約100 mg，加入冰預冷的適量細胞裂解液，制成心肌細胞均漿。冰上裂解40 min，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，收集上清，按照說明書進行定量測定。采用Western blotting法檢測MMP-2、TIMP-1蛋白的表達（ 美國ImmunoWay公司，批號YT2798、YT4658） 。上樣量80 μ g，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜上；一抗稀釋濃度1∶100，ECL檢測試劑盒顯影，洗片。以 β-actin（1∶200稀釋） 雜交作為內參照。目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，即為蛋白的相對定量值［8］。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 心胸比率測定

與對照組比較，模型組心胸比率明顯增加 （ P ＜0.05） 。與模型組比較，各藥物組均能減低心胸比率（P ＜ 0.05） ，其中芪藶強心組和高劑量組減低心胸比率尤為明顯，且與中、低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） 。見表1。

表1 各組大鼠心胸比率和BNP的比較Tab.1 Comparison of cardiothoracic ratios and BNP levels among the rats in all the groups

2.2 血清BNP測定

與對照組比較，模型組BNP明顯升高 （P ＜ 0.05） 。與模型組比較，各藥物組均能降低BNP水平 （ P ＜0.05） ，其中芪藶強心組和高劑量組降低BNP尤為明顯，且與中、低劑量組比較差異具有統(tǒng)計學意義 （ P ＜0.05） 。見表1。

2.3 心臟組織病理學檢查

2.3.1 HE染色：對照組心肌細胞排列整齊，細胞核呈卵圓形，著色較淺無深染，未見心肌細胞肥大，間質無炎癥細胞浸潤；模型組細胞排列疏松，橫紋不清楚，心肌纖維及間質發(fā)生壞死，細胞水腫，胞質著色變淺，細胞核出現(xiàn)深染改變，有炎癥細胞浸潤；參桂保心高、中、低劑量組和芪藶強心組心肌細胞肥大、炎癥細胞浸潤、心肌纖維走形等均得到不同程度的改善。見圖3。

圖3 各組大鼠心臟組織HE染色 ×100Fig.3 Hematoxylin-eosin staining of the heart tissue of the rats in each group ×100

2.3.2 病理評分：與對照組比較，模型組病理評分明顯增加 （P ＜ 0.05） 。與模型組比較，各藥物組病理評分均有所改善 （P ＜ 0.05） ，其中芪藶強心組和高、中劑量組優(yōu)于低劑量組 （P ＜ 0.05） 。見表2。

表2 各組大鼠心臟病理評分的比較Tab.2 Comparison of the cardiac pathological scores among the rats in all the groups

2.4 免疫組化檢測心肌MMP-2和TIMP-1蛋白表達

對照組心肌細胞僅有極少量標記，散在分布，胞質呈淡黃色。模型組陽性心肌細胞胞質染色程度較強，呈棕黃色或棕褐色，表達面積廣泛融合。各藥物治療組陽性細胞染色程度及面積低于模型組，高于正常組。見圖4、5。

MMP-2和TIMP-1表達的免疫組化結果顯示，蛋白表達多少與灰度值大小成反比，免疫結果著色越深，蛋白表達越強，灰度值越小。MMP-2表達方面，與對照組比較，模型組MMP-2表達明顯增加，故模型組灰度值明顯低于對照組 （P ＜ 0.05） 。與模型組比較，各藥物組蛋白表達均有減少 （P ＜ 0.05） 。與芪藶強心組比較，高劑量組優(yōu)于芪藶強心組 （P ＜ 0.05） 。TIMP-1表達方面，與對照組比較，模型組TIMP-1表達明顯減少，模型組灰度值明顯高于對照組 （ P ＜ 0.05） 。與模型組比較，芪藶強心組和高劑量組蛋白表達均有增加 （P ＜ 0.05） 。見表3。

圖4 各組大鼠心肌MMP-2蛋白表達 ×400Fig.4 MMP-2 protein expression in the myocardium of the rats in each group ×400

圖5 各組大鼠心肌TIMP-1蛋白表達 ×400Fig.5 TIMP-1 protein expression in the myocardium of the rats in each group ×400

2.5 Western blotting檢測MMP-2和TIMP-1蛋白表達水平及MMP-2/TIMP-1比值

表3 各組大鼠MMP-2和TIMP-1表達的灰度值比較Tab.3 Comparison of grayscale values of MMP-2 and TIMP-1 expressions among the rats in all the groups

2.5.1 各組大鼠心肌MMP-2蛋白表達水平：與對照組比較，模型組MMP-2表達水平明顯增高 （ P ＜ 0.05） 。與模型組比較，芪藶強心組和高、中劑量組MMP-2表達水平均有所降低 （P ＜ 0.05） ，其中高劑量組優(yōu)于芪藶強心組和中劑量組 （P ＜ 0.05） 。見圖6、表4。

2.5.2 各組大鼠心肌TIMP-1蛋白表達水平：與對照組比較，模型組MMP-2/TIMP-1比值明顯增高 （P ＜0.05） 。與模型組比較，芪藶強心組和高劑量組MMP-2/TIMP-1比值均有所降低 （P ＜ 0.05） 。見圖6、表4。

圖6 各組大鼠心肌MMP-2、TIMP-1蛋白表達水平Fig.6 MMP-2 and TIMP-1 protein expressions in the myocardium of the rats in all the groups

3 討論

CHF的主要發(fā)病機制是心室重構，而ECM的合成與降解失衡是心室重構的重要方面。研究［9］證明，MMP-2在慢性心衰心肌中的表達量及活性顯著增加，使膠原網(wǎng)絡發(fā)生重構，最終導致心室擴大，這些表明MMP-2直接參與了心室重構過程。TIMPs是MMPs特異性內源抑制因子，通過阻斷MMPs與底物結合，抑制MMPs的活性，其中TIMP-1主要抑制MMP-2的活性。MMP-2/TIMP-1的動態(tài)平衡是維持ECM合成與降解平衡的重要因素，隨著MMP-2活性升高，TIMP-1活性降低［10］。

表4 各組大鼠心肌MMP-2、TIMP-1蛋白表達水平及MMP-2/TIMP-1的比較Tab.4 Expression of MMP-2，TIMP-1 protein in myocardium of rats in each group and comparison of MMP-2/TIMP-1

BNP是一種心臟神經(jīng)內分泌激素，CHF時心室壁張力增加、容量負荷增重等因素均可導致其分泌，其生理作用主要有利尿排鈉、擴張血管、抑制心室重構等。BNP水平與心力衰竭的嚴重程度呈正相關，國內外多個心衰指南均將其作為診斷心力衰竭、判斷心力衰竭嚴重程度及預后的敏感指標。

本研究結果顯示，在心胸比率及BNP方面，治療后各組均有下降，芪藶強心及高劑量組尤為明顯，提示中藥具有減輕容量負荷、改善心功能的作用；在HE染色方面，治療后各組細胞水腫、炎性浸潤、病理評分等均有不同程度的改善，提示中藥具有保護心肌細胞、抑制心室重構的作用；在蛋白表達方面，治療后各組MMP-2表達均有減少，其中高劑量組優(yōu)于芪藶強心組。治療后芪藶強心和高劑量組MMP-2/TIMP-1比值均有降低且優(yōu)于其他各組，提示參桂保心方可能通過調節(jié)MMP-2/TIMP-1的動態(tài)平衡，維持ECM合成與降解平衡，達到抑制心室重構的作用。

綜上，參桂保心高劑量及芪藶強心膠囊均能降低心力衰竭大鼠的心胸比率及BNP水平、改善心臟組織病理學評分、減少MMP-2蛋白表達及MMP-2/TIMP-1比值，其中在減少MMP-2表達方面參桂保心高劑量更優(yōu)于芪藶強心膠囊，這些均可能是參桂保心方抑制心室重構、改善心臟功能的作用機制。

［1］ 張秋月，王保和，劉偉爽. 益氣復脈方對慢性心衰大鼠基質金屬蛋白酶活性調節(jié)作用的實驗研究［J］. 中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2016，14（ 9） ：825-829. DOI：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.08.009.

［2］ 馬曉慶，鐘栩，黨嬋娟. 參桂保心濃煎劑對心衰大鼠NT-proBNP及Caspase-3的 影 響［J］. 西 部 中 醫(yī) 藥，2016，29（7） ：8-11. DOI：10.3969/j.issn.1004-6852.2016.07.003.

［3］ 羅時珂，李萍，程曉曙. 異丙腎上腺素誘導慢性心力衰竭大鼠模型 的 建 立［J］. 重 慶 醫(yī) 學，2011，41（ s1） ：352-354. DOI：10.3969/j.issn.1000-2200.2008.03.007.

［4］ 韓克，吳格如，席雨濤. 容量超負荷心力衰竭大鼠模型的制備及心臟功能的超聲評價［J］. 中國循證心血管醫(yī)學雜志，2013，（ 5） ：507-509. DOI：10.3969/j.1674-4055.2013.05.24.

［5］ 徐叔云. 藥理實驗方法學［M］. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：201-206

［6］ 蔡輝，李箏，焦東東. 美托洛爾對充血性心力衰竭大鼠血漿醛固酮濃度、心肌纖維化和心室重構的影響［J］. 微循環(huán)學雜志，2010，20（ 1） ：13-15. DOI：10.3969/j.issn.1005-1740.2010.01.005.

［7］ 趙偉濤，徐增政，賈桂貞. 芪藶強心膠囊對心衰大鼠MMP-2、MMP-9表達的影響［J］. 醫(yī)學理論與實踐，2016，29（17） ：3002-3003. DOI：10.19381/j.issn.1001-7585.2016.17.003.

［8］ 龔明玉，杜超，蘇玲. 燈盞花素對缺血再灌注大鼠心肌Caspase-9蛋白及mRNA表達的影響［J］. 中國老年學，2013，33（ 2） ：347-349.DOI：10.3969/j.issn. 1005-9202.2013.02.046 .

［9］ BERGMAN MR，TEERLIMK JR，MAHINKAR R，et al. Cardiac matrix metalloproteinase-2 expression in dependently induces marked ventricular remodeling and systolic dysfunction［ J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292（ 4） ：1847-1860.

［10］ 張艷，廖佳丹，王彩玲. 不同中藥復方對慢性心衰大鼠MMP-2、TIMP-2的影響［J］. 北京中醫(yī)藥大學學報，2013，36 （ 6） ：409-412.DOI：10.3969/j.issn. 1006-2157.2013.06.011.