蔣昱，黃傳君，李澤，張才擎

（1. 山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科，濟南 250012； 2. 山東省千佛山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，濟南 250013； 3. 臨沂市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 臨沂 276017）

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞 （嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及上皮細(xì)胞） 和細(xì)胞組分介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，主要發(fā)病機制是氣道炎癥-免疫和神經(jīng)調(diào)節(jié)機制失衡［1］。氣道炎癥以及氣道上皮損傷/修復(fù)的遷延極易引起重塑，表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞黏液化生、上皮下膠原沉積、平滑肌細(xì)胞增生/肥大等。氣道重塑呈現(xiàn)進行性發(fā)展，是進一步導(dǎo)致不可逆性氣流受限和持續(xù)性氣道高反應(yīng)（airway hyperresponsiveness，AHR） 的重要因素，并且是激素抵抗的關(guān)鍵原因，最終誘導(dǎo)難治性哮喘的慢性化［2］。Wnt7b/β-catenin信號通路存在于多種組織細(xì)胞的增殖、分化中，呈高度保守，最新研究［3］發(fā)現(xiàn)它對哮喘氣道炎癥和重塑具有非常重要的作用。本研究主要針對白三烯受體拮抗劑多靶點的藥理作用特點，以BALB/C小鼠模型為研究對象，探究Wnt/β-catenin信號通路在哮喘小鼠氣道重塑方面的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

40只SPF級BALB/C雌性小鼠（ 7～8周齡，體質(zhì)量15～20 g，購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心） ；孟魯司特鈉咀嚼片（ 4 mg/ 片，杭州默沙東制藥有限公司） 。雞清卵蛋白（ ovalbumin，OVA） （ 美國Sigma公司） ；Wnt7b、β-catenin及c-Myc抗體（ 英國Abcam公司） ；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（ 中國碧云天生物技術(shù)研究所） ；TRIzol試劑液及引物（ 美國Invitrogen 公司） ；SYBR Premix Ex Taq 及 PrimeScript RT 試劑盒（ 日本TaKaRa 公司） ；980超聲霧化儀（ 上海新天緣醫(yī)療設(shè)備有限公司） 。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立：將30只小鼠按照隨機數(shù)字表分為對照組、哮喘組和孟魯司特鈉組，每組10只。哮喘組在實驗1、8、15 d腹腔注射0.5 mL含0.1 mg OVA及1 mg氫氧化鋁凝膠佐劑的生理鹽水致敏，15～28 d在自制箱中 （30 cm×25 cm×30 cm） 每天給予5%OVA霧化30 min，激發(fā)建立哮喘小鼠模型，孟魯司特鈉組在霧化OVA 溶液2 h前，按照1 mg/kg的劑量灌胃給藥，孟魯司特鈉藥物劑量根據(jù)藥物劑量計算公式估算推出，1次/d［4］。對照組小鼠采用生理鹽水替代進行灌胃及霧化處理，其余處理相同，28 d后用于實驗。

1.2.2 標(biāo)本的采集：第28天最后1次霧化后，在24 h內(nèi)用10%水合氯醛注射麻醉處死小鼠，摘取眼球取血，低溫離心后取上清備用，將小鼠置于解剖臺固定，剪開胸頸部暴露氣管，取支氣管和肺，部分在液氮中凍存用于Western blotting和實時PCR，部分肺組織浸泡于4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片，用于HE染色和圖像采集。

1.2.3 HE染色及圖像采集：將部分支氣管和肺組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋以及石蠟以4～6 μ m切片后，甲苯脫蠟及乙醇復(fù)水，然后蘇木素染色、沖洗、伊紅染色，乙醇脫水中性樹膠封片。

1.2.4 ELISA 法檢測血清 OVA-sIgE 的表達(dá)：按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔，分別加樣、顯色液，最后加入終止液終止，利用酶標(biāo)儀按照 450 nm波長測量各孔的OD值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品OVA-sIgE 的濃度。

1.2.5 Western blotting檢測肺組織提取蛋白中Wnt7b、β-catenin和c-Myc含量：取100 mg小鼠肺組織標(biāo)本加入0.5 mL的裂解液（ RIPA∶PMSF=100∶1） ，冰上剪碎并勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心 15 min，取上清液加入上樣緩沖液，金屬浴95 ℃，5 min分裝后置于-80 ℃冰箱中保存，配制10%分離膠和5%濃縮膠進行蛋白凝膠電泳，接著將蛋白轉(zhuǎn)膜到 0.22 μ m的 PVDF 膜上，并用5% 脫脂牛奶封閉，Wnt7b單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體及c-Myc單克隆抗體按照1∶100稀釋，內(nèi)參（ 山羊抗兔GAPDH抗體1∶3 000） 4 ℃ 孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（ 1∶5 000） 37 ℃孵育2 h后，ECL發(fā)光試劑盒顯影。結(jié)果用 ImageJ2×軟件分析測定條帶的積分光密度值的峰面積。

1.2.6 實時 PCR 法檢測Wnt7b、β-catenin及c-Myc mRNA表達(dá)：分別取每只小鼠肺組織稱重剪碎，加入適量TRIzol提取總RNA，按照試劑盒說明，取2 μ g總RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。取cDNA產(chǎn)物2 μ L，SYBR 預(yù)混液 16 μ L、上下游引物 2 μ L 共計 20 μ L總 反 應(yīng) 體系 行 實 時 定 量 PCR。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性90 s，95 ℃退火5 s，55 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，用熒光定量 PCR 儀（ ABI7500） 自動分析并計算出每個樣本的CT值，實驗組Wnt7b、β-catenin及c-Myc mRNA相對于對照組基因表達(dá)倍數(shù)采用 2-ΔΔCT進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.7 圖像采集分析：將肺組織切片在顯微鏡下放大200倍，觀察各組小鼠肺泡及支氣管周圍炎癥程度，每只小鼠選取3個具有完整的小支氣管且直徑100～200 μ m的橫截圖像，運用圖像采集系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測定支氣管管腔周長 （basement membrane perimeter，PBM） 、支氣管管壁面積 （wall area of bronchial tube，WAt） 、支氣管管壁平滑肌面積 （wall area of bronchial smooth muscle，WAm） 和平滑肌細(xì)胞計數(shù) （the number of bronchial smooth muscle cells，N） ，上述指標(biāo)用PBM標(biāo)準(zhǔn)化，分別以 WAt / PBM、WAm /PBM、N / PBM表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析 （one-way ANOVA ） ，多組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理切片HE染色比較

結(jié)果顯示，對照組小鼠支氣管黏膜完整，光滑，無充血水腫，支氣管上皮細(xì)胞排列有序，上皮基底膜無增厚、無炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。哮喘組小鼠支氣管壁增厚狹窄，黏膜充血水腫，基底膜增厚斷裂，支氣管壁和血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤；孟魯司特鈉組小鼠支氣管黏膜充血水腫，基底膜增厚及炎癥細(xì)胞浸潤程度均較哮喘組輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色 ×200Fig.1 H&E staining of the lung tissue from each group ×200

2.2 各組小鼠ELISA 檢測結(jié)果比較

結(jié)果顯示，哮喘組小鼠血清 OVA-sIgE 明顯高于對照組 （P ＜ 0.05） ，孟魯司特鈉組血清 OVA-sIgE水平低于哮喘組但仍高于對照組 （P ＜ 0.05） ，造模成功。見圖 2。

圖2 各組小鼠血清 OVA-sIgE 表達(dá)水平Fig.2 Serum OVA-slgE expression levels in each group

2.3 Western blotting 檢測各組小鼠肺組織提取蛋白中Wnt7b、β-catenin及c-Myc水平

結(jié)果顯示，哮喘組小鼠肺組織中Wnt7b的表達(dá)明顯高于孟魯司特鈉組 （P ＜ 0.05） ；β-catenin及c-Myc在哮喘組表達(dá)明顯較對照組升高，在孟魯司特鈉組較低，但仍高于對照組。見表1。

2.4 實時 PCR 檢測各組肺組織Wnt7b、β-catenin及c-Myc mRNA的表達(dá)結(jié)果

實時 PCR 結(jié)果顯示，哮喘組小鼠肺組織Wnt7b、β-catenin及c-Myc mRNA相對表達(dá)量均明顯高于對照組 （P ＜ 0.05） ，孟魯司特鈉組 Wnt7b、β-catenin及c-Myc mRNA 水平低于哮喘組，但均高于對照組（P ＜ 0.05） ，見表2。

2.5 各組小鼠WAt /PBM、WAm /PBM、N /PBM比較

結(jié)果顯示，孟魯司特鈉組小鼠WAt/PBM、WAm /PBM低于哮喘組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P ＜0.05） ，見表3。

表1 各組小鼠肺組織中Wnt7b、β-catenin和c-Myc的蛋白表達(dá) （±s）Tab.1 The expression of Wnt7b，β-catenin，and c-Myc in the lung tissue of mice （±s）

表1 各組小鼠肺組織中Wnt7b、β-catenin和c-Myc的蛋白表達(dá) （±s）Tab.1 The expression of Wnt7b，β-catenin，and c-Myc in the lung tissue of mice （±s）

1） P ＜ 0.05 vs control group；2） P ＜ 0.05 vs asthma group.

Group Wnt7b protein β-catenin protein c-Myc protein Control 0.10±0.05 0.24±0.04 0.29±0.03 Asthma 0.20±0.08 1） 0.42±0.09 1） 0.47±0.11 1）Montelukast 0.13±0.07 2） 0.33±0.05 2） 0.37±0.07 2）

表2 各組小鼠肺組織中Wnt7b、β-catenin和c-Myc mRNA表達(dá) （±s）Tab.2 The mRNA expression of Wnt7b，β-catenin，and c-Myc in the lung tissue of mice （±s）

表2 各組小鼠肺組織中Wnt7b、β-catenin和c-Myc mRNA表達(dá) （±s）Tab.2 The mRNA expression of Wnt7b，β-catenin，and c-Myc in the lung tissue of mice （±s）

1） P ＜ 0.05 vs control group；2） P ＜ 0.05 vs asthma group.

Group Wnt7b mRNA β-catenin mRNA c-Myc mRNA Control 1.52±0.25 1.15±0.31 1.12±0.27 Asthma 8.21±1.311） 2.03±0.721） 3.71±0.931）Montelukast 3.78±0.672） 1.55±0.392） 1.84±0.692）

表3 各組小鼠WA t /PBM、WAm /PBM、N /PBM的比較 （±s）Tab.3 The comparison of WAt/PBM，WAm/PBM，and N/PBM ratios in mice （±s）

表3 各組小鼠WA t /PBM、WAm /PBM、N /PBM的比較 （±s）Tab.3 The comparison of WAt/PBM，WAm/PBM，and N/PBM ratios in mice （±s）

1） P ＜ 0.05 vs control group；2） P ＜ 0.05 vs asthma group.

GroupWAt/PBM （μ m2 /μ m）WAm/PBM （μ m2 /μ m）N/PBM （N/μ m）Control 5.6±2.1 3.3±1.8 0.03±0.02 Asthma 18.2±4.71） 8.8±3.51） 0.08±0.031）Montelukast 10.2±3.92） 6.1±3.72） 0.05±0.022）

3 討論

氣道重塑是引起支氣管哮喘不可逆性氣流受限的重要因素，也是激素抵抗的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，積極預(yù)防改善氣道重塑在支氣管哮喘的治療中尤為重要。Wnt通路是人體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，它廣泛存在于各組織細(xì)胞中，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及胚胎發(fā)育等多種生理過程，Wnt基因位于12q13上［5］，Wnt信號通路主要有家族分泌蛋白、散亂蛋白、β-catenin、卷曲蛋白 （frizzled，F(xiàn)rz） 及糖原合成酶激酶 3β組成。在正常的成熟細(xì)胞中Wnt基因并不表達(dá)，處于沉默狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到慢性炎癥，理化因子長期刺激以及細(xì)胞癌變的過程時Wnt基因本身或是下游信號成分改變而被激發(fā)。Wnt信號通路主要通過Wnt蛋白受體、胞內(nèi)蛋白、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄等途徑激活下游基因的表達(dá)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Wnt7b是Wnt信號蛋白家族成員之一，并參與經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路，與Frz 跨膜受體結(jié)合后進行信號傳遞［6］。Wnt7b主要在肺組織上皮表達(dá)，在胚胎時期便參與肺的發(fā)育和維持血管平滑肌的完整［7］。β-catenin位于經(jīng)典Wnt信號通路的中心環(huán)節(jié)，它在細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)異常累積轉(zhuǎn)錄激活Wnt反應(yīng)基因。以往的研究［8］發(fā)現(xiàn)，β-catenin與多種惡性腫瘤（直腸腺癌、卵巢癌及乳癌）的發(fā)生相關(guān)，它是一種多功能細(xì)胞質(zhì)可溶性蛋白，其在胞質(zhì)內(nèi)過量表達(dá)時，可以向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并在c-myc、Cyclin D1的催化下與LEF轉(zhuǎn)錄子結(jié)合，引起細(xì)胞增殖異常，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。而近年研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，不僅僅是在惡性腫瘤，支氣管過度收縮或是拉伸可以激活β-catenin，并使其在氣道上皮以細(xì)胞增殖、分化、組織修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn)等方式參與組織修復(fù)、促纖維化以及哮喘氣道重塑。c-Myc是β-catenin下游最為重要的靶基因之一，其本質(zhì)是一種原癌基因，可與染色體 DNA 結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，朱等［11］研究表明，在哮喘疾病中β-catenin和c-Myc的含量與氣道重塑的程度成正相關(guān)，促進細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放，與氣道炎癥和氣道重塑密切相關(guān)。

近幾年白三烯受體拮抗劑作為非類固醇類平喘抗炎藥療效確切，它能抑制炎癥細(xì)胞黏附、聚集和增殖，阻止氣道平滑肌細(xì)胞增生，上皮下膠原的沉積以及上皮下纖維化，具有抑制氣道重塑和抗纖維化的作用［12-13］。白三烯受體拮抗劑具有多種藥理作用，在哮喘疾病的治療中，能在不同的信號通路中發(fā)揮抗炎抗氣道重塑的作用，如減少Th2型白介素 （IL-4、IL-5及IL-13） 、 TGF-β及MMP-9等［14-15］。本研究結(jié)果顯示，孟魯司特鈉組小鼠支氣管無明顯增厚，管腔無過多分泌物，亦未見周圍炎癥細(xì)胞浸潤，且Wnt7b、β-catenin、c-Myc及氣道重塑指標(biāo)WAt /PBM、WAm /PBM的表達(dá)明顯低于哮喘組小鼠，這說明白三烯受體拮抗劑可以通過Wnt/β-catenin信號通路抑制哮喘的炎癥反應(yīng)和氣道重塑。在BELLER等［16］研究中發(fā)現(xiàn)白三烯受體拮抗劑具有強大抗炎和抗纖維化作用，對氣道形態(tài)具有逆轉(zhuǎn)作用。因此推測哮喘是體內(nèi)外因素影響作用下體內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路被激活，并且相互作用共同促進氣道平滑肌細(xì)胞分裂增殖，加劇氣道炎癥和氣道重塑，白三烯受體拮抗劑可能通過抑制Wnt/β-catenin的異常累積，減少下游炎性細(xì)胞因子表達(dá)，在信號通路的上游水平進行控制，減輕炎癥和氣道高反應(yīng)。白三烯受體拮抗劑抑制氣道重塑與通路中各分子之間具體關(guān)系還有待進一步研究。

［1］ HOSHINO M，OHTAWA J，AKITSU K. Association of airway wall thickness with serum periostin in steroid-naive asthma ［J］.Allergy Asthma Proc，2016，37 （3） ：225-230. DOI：10.2500/aap.2016.37.3945.

［2］ YANG ZC，YI MJ，SHAN YC，et al. Targeted inhibition of Six1 attenuates allergic airway inflammation and remodeling in asthmatic mice［J］. Biomed Pharmacother，2016，12 （84） ：1820-1825. DOI：10.1016/j.biopha.2016.10.090.

［3］ BARRETO-LUIS A，CORRALES A，ACOSTA-HERRERA M，et al.A pathway-based association study reveals variants from Wnt signalinggenes contributing to asthma susceptibility ［J］. Clin Exp Allergy，2017，47（ 5） ：618-626. DOI：10.1111/cea.12883.

［4］ 陳奇，孫瑞元，鄧文龍，等. 中藥藥理研究方法學(xué)［ M］. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：33-34.

［5］ SHARMA S，TANTISIRA K，CAREY V，et al. A role for Wnt signaling genes in the pathogenesis of impaired lung function in asthma［ J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，181（ 4） ：328-336. DOI：10.1164/rccm.200907-1009OC.

［6］ YAN Z，KUI Z，PING Z. Reviews and prospectives of signaling pathway analysis in idiopathic pulmonary fibrosis［ J］. Autoimmun Rev，2014，13（ 10） ：1020-1025. DOI：10.1016/j.autrev.2014.08.028.

［7］ COHEN ED，IHIDA-STANSBURY SK，LU MM，et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway［ J］. J Clin Invest，2009，119（ 9） ：2538-2549. DOI：10.1172/JCI38079.

［8］ BILIC J，HUANG YL，DAVIDSON G，et al. Wnt induces LRP6 signalosomes and promotes dishevelled-dependent LRP6 phosphorylation［ J］. Science，2007，316（ 5831） ：1619-1622. DOI： 10.1126/science.1137065.

［9］ YAO L，ZHAO H，TANG H，et al. Blockade of β-catenin signaling attenuates toluene diisocyanate-induced experimentalasthma［ J］. Allergy，2017，72（ 4） ：579-589. DOI：10.1111/all.13045.

［10］ FANG C，LU W，LI C，et al. MiR-3162-3p is a novel microRNA that exacerbates asthma by regulating β-catenin［ J］. PLoS One，2016，11（ 3） ：1-16. DOI：10.1371/journal.pone.0149257.

［11］朱婷婷，翁翠葉，賈宵宵，等. Wnt7b/β-catenin信號通路在大鼠哮喘氣道重塑中的作用［J］. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，47（ 1） ：14-18. DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.003.

［12］ TENERO L，PIAZZA M，SANDRI M，et al. Effect of montelukast on markers of airway remodeling in children with asthma［ J］. Allergy Asthma Proc，2016，37（ 5） ：77-83. DOI：10.2500/aap.2016.37.3978.

［13］ CI KOWSKI J，MAZUREK H，HYDZIK P，et al. Inflammatory markers as exacerbation risk factors after asthma therapy switch from inhaled steroids to montelukast［ J］. Pulm Pharmacol Ther，2016，39（8） ：7-13. DOI：10.1016/j.pupt.2016.05.002.

［14］ PENG J，ZHOU H，KUANG G，et al. The selective cysteinyl leukotriene receptor 1 （ CysLT1R） antagonistmontelukast regulates extracellular matrix remodeling［ J］. Biochem Biophys Res Commun，2017，484（ 3） ：474-479. DOI：10.1016/j.bbrc.2017.01.052.

［15］ CHAN PH，TO CY，CHAN EY，et al. A randomized placebo-controlled trial of traditional Chinese medicine as an add-on therapy to oral montelukast in the treatment of mild persistent asthma in children［ J］. Complement Ther Med，2016，29（ 12） ：219-228. DOI：10.1016/j.ctim.2016.10.010.

［16］ BELLER TC，F(xiàn)RIEND DS，MAEKAWA A，et al. Cysteinyl leukotriene 1 receptor controls the severity of chronic pulmonary inflammation and fibrosis［ J］. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（ 9） ：3047-3052. DOI：10.1073/pnas.0400235101.