張?zhí)K寧，劉宗昂

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胸外科，沈陽(yáng) 110004）

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首，其中，小細(xì)胞肺癌 （small cell lung cancer，SCLC） 約占肺癌的20%～25%。約90%的SCLC患者在確診時(shí)已有轉(zhuǎn)移，因此，其早期診斷與治療愈發(fā)重要，尋求特異性與敏感性高的腫瘤標(biāo)志物是臨床開展早期診斷項(xiàng)目最重要的一環(huán)。

乳腺癌缺失基因1 （deleted in breast cancer-1，DBC1） 最初由HAMAGUCHI等［1］應(yīng)用代表性差異分析 （representational difference analysis，RDA） 篩選獲得，因其在乳腺癌組織中雜合性缺失而得名乳腺癌缺失基因，定位于8p2l。研究［2-7］發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系和實(shí)體腫瘤組織標(biāo)本中，DBC1并未出現(xiàn)表達(dá)缺失，其表達(dá)水平在腫瘤組織中明顯高于相應(yīng)的正常組織，且與組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總體生存時(shí)間、無病生存時(shí)間等臨床指標(biāo)密切相關(guān)。

本研究回顧性分析了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院73例SCLC患者的臨床資料，對(duì)上述患者肺癌組織標(biāo)本中DBC1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，并分析了DBC1表達(dá)與SCLC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和生存期之間的關(guān)系，旨在探討DBC1作為SCLC預(yù)后分子標(biāo)志的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源：收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)院2009年12月至2013年6月期間手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為SCLC的石蠟標(biāo)本73例。按照2007年第八版UICC-AJCC （Union for International Cancer Control-American Joint Committee on Cancer） 對(duì)SCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺癌病理分型及分期。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及儀器：-80 ℃超低溫冰箱 （中國(guó)Haier公司） ；高速冷凍離心機(jī) （SorvallTMLegendTMMicro 21 Microcentrifuge，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司） ；mirVana PARIS Kit （美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司） ；NanoDropND-1000紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司） ；Real-time 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （日本TaKaRa公司） ；DBC1、內(nèi)參RNU6B引物 （美國(guó)Applied Biosystems公司） ；Cobas z480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 （瑞士Roche公司） ；miRNA qPCR Kit（美國(guó)GeneCopoeia公司） 。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR：按照mirVana PARIS Kit試劑盒說明書操作，提取肺癌石蠟組織總RNA，50 μ L DEPC稀釋后-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。按照Real-time 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取RNA 500 ng，冰上加入5×PrimeScript Buffer 2 μ L，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 0.5 μ L，Oligo dT Primer 0.5 μ L，Random 6 mers 0.5 μ L，total RNA 500 ng，DECP水，總體積 10 μ L。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 15 min，反應(yīng)完畢后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照miRNA qPCR Kit試劑盒說明書行實(shí)時(shí)定量PCR，加入qPCR Mix 10 μ L，上游引物 （2 μ mol/L） 2 μ L，下游引物 （2 μ mol/L）2 μ L，cDNA 2 μ L，加入DEPC水至20 μ L，置于Cobas z480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min預(yù)變性，后按95 ℃ 10 s變性、-2 ℃ 20 s 退火、72 ℃10 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 隨訪：電話隨訪全部73例患者，了解患者生存情況，隨訪截止時(shí)間為2017年5月，隨訪時(shí)間11～64個(gè)月。其中6例患者失訪，3例患者隨訪截止時(shí)仍存活。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)DBC1相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，采用2-ΔΔCt方法，把2-ΔΔCt中位數(shù)作為分界值，將患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組。DBC1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)分析，采用Kaplan-Meier方法計(jì)算SCLC生存指標(biāo)，并采用log-rank檢驗(yàn)比較生存率，采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析預(yù)后的獨(dú)立影響因素。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本資料

共收集SCLC患者資料73例，其中男59例，女14例；年齡≥60歲36例，＜60歲37例；吸煙56例，不吸煙17例；局限期33例，廣泛期40例；有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移46例，無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移27例。

2.2 DBC1表達(dá)與SCLC患者預(yù)后參數(shù)的相關(guān)性

根據(jù)DBC1的表達(dá)量，將73例肺癌患者分為高表達(dá)組 （57例） 和低表達(dá)組 （16例） 。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，DBC1的表達(dá)量在不同性別 （χ2=0.332，P = 0.123） 、年齡 （χ2=0.188，P = 0.394） 及吸煙史 （χ2=0.504，P = 0.106） 等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） 。DBC1表達(dá)量與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=5.723，P = 0.017；χ2=10.748，P = 0.001），其中，有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肺癌患者中，DBC1高表達(dá)40例，低表達(dá)6例；無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肺癌患者中DBC1高表達(dá)17例，低表達(dá)10例。局限期患者中DBC1高表達(dá)20例，低表達(dá)13例；廣泛期患者中DBC1高表達(dá)37例，低表達(dá)3例。

2.3 DBC1表達(dá)水平與SCLC患者生存及預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier方法計(jì)算不同DBC1表達(dá)水平組的SCLC生存率，并采用log-rank檢驗(yàn)比較生存率。結(jié)果顯示，DBC1高表達(dá)組患者的中位無病生存時(shí)間 （disease free survival，DFS） （17個(gè)月） 明顯較低表達(dá)組 （21個(gè)月） 縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P =0.007） （圖1） ，DBC1高表達(dá)組患者的中位總生存時(shí)間 （overall survival，OS） （27個(gè)月） 明顯較低表達(dá)組患者 （30個(gè)月） 縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P = 0.043）（圖2） 。同時(shí)，腫瘤分期 （P ＜ 0.001） 及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移 （P ＜0.001） 也與SCLC患者預(yù)后相關(guān)，廣泛期或有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或DBC1表達(dá)水平高的SCLC患者預(yù)后較差。Cox回歸模型多因素分析顯示：分期 （P ＜ 0.001） 、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移 （P ＜ 0.001） 和DBC1高表達(dá) （P ＜ 0.001） 是SCLC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素 （表1） 。

圖1 無病生存時(shí)間Fig.1 Disease-free survival time.

圖2 總生存時(shí)間Fig.2 Overall survival time

3 討論

肺癌主要包括包括非SCLC、SCLC及其他類型，近年來SCLC的發(fā)病率緩慢上升，尤其在女性中發(fā)病率逐年上升。盡管SCLC的早期診斷和臨床綜合治療水平近幾年提升迅速，但預(yù)后仍不佳［8］。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，某些基因表達(dá)的變化不僅能夠準(zhǔn)確地反映腫瘤特性，而且能夠更為準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞的基因組學(xué)及表觀遺傳學(xué)變化，從而成為腫瘤研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。

DBC1的生理和病理功能目前還知之甚少。雖然最初報(bào)道DBC1可以抑制p53的去乙?；饔茫徽J(rèn)為是腫瘤抑制基因，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)DBC1并不是在所有的癌組織中都是表達(dá)缺失的，DNA微陣列數(shù)據(jù)顯示，與正常乳腺組織相比較，乳腺癌組織中DBC1的表達(dá)是上調(diào)的［9］。DBC1相關(guān)機(jī)制研究［4，10-12］發(fā)現(xiàn)DBC1通過影響SIRT1、ER等分子的表達(dá)和甲基化，參與調(diào)控細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡及組蛋白修飾等生理病理過程。研究［12-14］提示，CK2a可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)DBC1甲基化，通過調(diào)節(jié)caspase通路促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12-13］，DBC1還可直接結(jié)合SIRT1，抑制SIRT1的去乙酰化酶活性，影響SIRT1-p53通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］；這些結(jié)果提示DBC1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究回顧分析了73例SCLC患者的臨床資料，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了患者肺癌組織標(biāo)本中DBC1的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，研究DBC1與SCLC患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DBC1的表達(dá)與患者腫瘤是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與性別、年齡、分期及吸煙史均無明顯相關(guān)；DBC1的表達(dá)水平與患者生存期呈負(fù)相關(guān)，即DBC1高表達(dá)的患者生存期較短；分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和DBC1水平與SCLC患者預(yù)后相關(guān)，且均為獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上研究結(jié)果均提示DBC1高表達(dá)狀態(tài)可能是SCLC患者預(yù)后的不良因素，并與SCLC一線治療后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表1 SCLC患者預(yù)后COx多因素回歸分析Tab.1 COx multivariate regression analysis of the prognostic factors of SCLC patients

本研究作為回顧性分析有諸多局限性，如臨床資料不甚完整，無法根據(jù)腫瘤組織分化程度進(jìn)行更為精確的分組，未能取得手術(shù)患者瘤旁正常組織以作為腫瘤組織對(duì)照組等。本研究組正在進(jìn)行外周血DBC1表達(dá)水平指導(dǎo)SCLC患者治療方案的前瞻性研究，期待進(jìn)一步的數(shù)據(jù)證實(shí)本結(jié)果的可靠性。

總之，本研究結(jié)果表明DBC1高表達(dá)與SCLC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并提示SCLC患者預(yù)后不良，提示DBC1表達(dá)水平可以作為提示SCLC患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志。

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