黃銳 蒲清榮 任桂林 趙劍 楊思進(jìn) 白雪

摘要：目的 優(yōu)選丹參乙醇滲漉提取的最佳工藝。方法 以丹參酮ⅡA，二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I含量，干凈膏收率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察乙醇用量、乙醇濃度、浸泡時(shí)間、滲漉速度對(duì)丹參滲漉提取工藝的影響。結(jié)果 最佳滲漉工藝為丹參粗粉（過3號(hào)篩）加入4倍量，95%乙醇，浸泡48h，滲漉速度為每分鐘1 mL·min-1。結(jié)論 優(yōu)選的滲漉提取工藝設(shè)計(jì)合理，可為提取丹參脂溶性成分提供參考。

關(guān)鍵詞：丹參；滲漉提??；正交試驗(yàn)；丹參酮ⅡA；二氫丹參酮I；隱丹參酮；丹參酮I

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2018）02-0069-04

Study on Optimization of Extraction Technology of Salvia Miltiorrhiza Percolation

by Multi-index Comprehensive Weighting Scoring Method

HUANG Rui， PU Qing-rong， REN Gui-lin， ZHAO Jian， YANG Si-jin， BAI Xue

（The Affiliated Chinese Medicine Hospital of Southwest Medical University， Luzhou 646000， China）

【Abstract】Objective： To optimize the best process of ethanol percolation extraction from Salvia miltiorrhiza. Methods： By taking clean cream yield， the content of tanshinoneⅡA， dihydrotanshinone I， cryptotanshinone and tanshinone as indexes， single factor test and orthogonal test were used to determine the effects of ethanol dosage， ethanol concentration， soaking time and percolation speed on the extraction process of Salvia miltiorrhiza. Results： The optimum percolation process was to add 4 times amount of Salvia miltiorrhiza middlings （sieve No.3） and the 95% of ethanol， and soak for 48 hours. The percolation speed was 1 mL·min-1 per minute. Conclusion： The optimal percolation extraction process is reasonable and can provide reference for the extraction of fat-soluble components of Salvia miltiorrhiza.

【Key words】Salviae miltiorrhizae， percolation extraction， orthogonal test， tanshinoneⅡA， dihydrotanshinone I， cryptotanshinone， tanshinone I

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorhiza的干燥根及根莖，是臨床心血管最常用的中藥之一。具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰之功效[1]。丹參所含有效成分有水溶性和脂溶性兩大類，丹參脂溶性有效部位主要是以丹參酮I，丹參酮ⅡA，二氫丹參酮I，隱丹參酮，異丹參酮為代表的二萜蒽醌類成分，具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，抗動(dòng)脈粥樣硬化[2]，減輕缺氧引起的心肌損傷，促進(jìn)心肌再生[3]，抑制血小板凝集，降低全血和血漿黏度等[4]藥理作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-8]，丹參醇提工藝相對(duì)比較簡單，多以丹參酮ⅡA為單一評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究采用乙醇作為溶劑，以脂溶性成分丹參酮ⅡA，二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I，干浸膏收率作為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選丹參的滲漉工藝，為提取丹參脂溶性成分提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵、SPD20A檢測器、CTO-10AS進(jìn)樣器、LcSolution色譜工作站）；AUW120D電子天平（日本島津）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；JP全數(shù)字超聲波發(fā)生器（武漢嘉鵬電子有限公司）；BO-200T多功能粉碎機(jī)（永康鉑歐五金廠）；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱（杭州匯爾儀器服務(wù)有限公司）。

1.2 試藥 甲醇為色譜純（美國Fisher公司）；無水乙醇，乙醇（95%）為分析純（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；水為哇哈哈純凈水；對(duì)照品隱丹參酮（批號(hào)：110852-200806），丹參酮I（批號(hào)：110867-200406），丹參酮ⅡA（批號(hào)：110766-200619），均購自中國食品藥品檢定研究院。二氫丹參酮I（批號(hào)：140920），購自北京更新生物科技有限公司。丹參（批號(hào)：141020，購自瀘州天植中藥飲片有限公司，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室趙劍主任中藥師鑒定為唇形科植物丹參Savia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，符合中國藥典2015年版一部該藥材項(xiàng)下規(guī)定。）。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.03%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0-20min，20%A→60%A；20-120min，60%A→75%A）[9-10]，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，檢測波長270 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮ⅡA的對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成濃度為30.0，71.4，43.2，111.8 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取試驗(yàn)工藝中滲漉液，用對(duì)應(yīng)濃度的乙醇，定容至500 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分別于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，將上述6種混合溶液以及對(duì)照品混合溶液，取10 μL注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄峰面積。以對(duì)照品的濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積的積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮ⅡA回歸方程分別為：y=3.099×104x-3.303×103，y=6.120×104x-1.017×104，y=2.647×104x-8.523×104，y=5.805×104x-1.027×104；線性范圍分別為1.5～30，3.57～71.4，2.16～43.2，5.59～111.8 μg/mL；RSD分別為：0.9995，0.9996，0.9999，0.9996；均呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 樣品測定 取每個(gè)因素的樣品2份，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，供試品溶液10 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。對(duì)照品，樣品色譜圖見圖1。

2.2 綜合評(píng)分 以二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮ⅡA的含量、干凈膏收率為 綜合指標(biāo)（overall desirability OD）進(jìn)行直觀分析和方差分析[11-13]。各指標(biāo)綜合評(píng)分方程：di=Yi/Ai（di為各指標(biāo)的綜合評(píng)分值；Yi為各試驗(yàn)中各指標(biāo)的實(shí)測值；Ai為試驗(yàn)中各指標(biāo)中相應(yīng)的最大值）。因丹參酮ⅡA是丹參醇提部分中最主要的有效成分，二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I為相對(duì)次要的有效成分，故分別記30，20，20，20%，干浸膏收率為輔助考察指標(biāo)記10%。將每次試驗(yàn)的各指標(biāo)成分的綜合評(píng)分值，乘以加權(quán)系數(shù)后求和，按“綜合評(píng)分=di（丹參酮ⅡA相對(duì)含量）×30%+di（丹參酮I）×20%+di（隱丹參酮）×20%+di（二氫丹參酮I）×20%+di（干浸膏收率）×10%”即為綜合評(píng)分值。

2.3 干浸膏收率的測定 精密稱取丹參藥材48 g，加入一定濃度和體積的乙醇溶液進(jìn)行滲漉，滲漉液定容至500 mL，精密量取50 mL滲漉液，減壓濃縮至稠膏，置真空干燥箱中干燥，得到干浸膏，精密稱定，計(jì)算干浸膏收率。干浸膏收率=W干*（500/50）/W。W干為干浸膏重量，W為丹參藥材重量。

2.4 單因素試驗(yàn) 選取醇濃度、藥材粗細(xì)度、提取方法3個(gè)影響因素對(duì)丹參酮提取率進(jìn)行單因素考察。

2.4.1 乙醇濃度考察 稱取丹參藥材48 g，分別以60，70，80，90，95%和無水乙醇作為提取溶劑，浸潤24 h，溶劑用量8倍，滲漉流速2 mL/min，收集滲漉液。按2.3項(xiàng)下方法測定干凈膏收率。按2.1項(xiàng)下方法測定各指標(biāo)成分含量，計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)含量及綜合評(píng)分。結(jié)果綜合評(píng)分值：無水乙醇>95>90>80>70>60%，見表1。

2.4.2 藥材粗細(xì)度考察 稱取丹參藥材，丹參粗顆粒（過1號(hào)篩），丹參粗粉（過3號(hào)篩）各48 g，浸潤24 h，溶劑用量8倍，滲漉流速2 mL/min，收集滲漉液。按2.3項(xiàng)下方法測定干凈膏收率。按2.1項(xiàng)下方法測定各指標(biāo)成分含量，計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)含量及綜合評(píng)分。結(jié)果綜合評(píng)分值：丹參粗粉（過5號(hào)篩）>丹參粗顆粒（過1號(hào)篩）>丹參藥材，見表2。

2.4.3 提取方法考察 稱取丹參藥材48 g，分別以回流法，超聲法，滲漉法作為提取方法，浸泡24h，溶劑容量8倍，進(jìn)行相應(yīng)提取，提取液定容至500 mL。按2.3項(xiàng)下方法測定干凈膏收率。按2.1項(xiàng)下方法測定各指標(biāo)成分含量，計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)含量及綜合評(píng)分。結(jié)果綜合評(píng)分值：回流法>滲漉法>超聲法，各個(gè)指標(biāo)成分值回流法和滲漉法相差不大，從實(shí)際生產(chǎn)考慮，滲漉法提取相對(duì)安全，利于生產(chǎn)，因此采用滲漉 法提取丹參脂溶性有效部位，見表3。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，將丹參藥材粉粹成粗粉（過3號(hào)篩），精密稱取18份，每份48 g，采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，以丹參酮ⅡA，二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I的量、干凈膏收率為指標(biāo)，對(duì)乙醇用量（A）、乙醇濃度（B）、浸泡時(shí)間（C）、滲漉速度（D）等條件進(jìn)一步優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4、5，方差分析見表6。

表5表明，以丹參脂溶性有效部位和干浸膏收率的綜合評(píng)分值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，4個(gè)因素對(duì)提取效果影響順序?yàn)闈B漉速度>乙醇濃度>浸泡時(shí)間>乙醇用量，最佳提取工藝為A1B1C3D1，即加入4倍量，乙醇濃度95%，浸泡48h，滲漉速度為每分鐘1 mL·min-1。表6方差分析結(jié)果可知，滲漉速度具有顯著性差異，其他因素對(duì)收膏率和丹參脂溶性有效部位提取的影響都不顯著。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取同一批丹參粗粉（過3號(hào)篩），按綜合評(píng)分法優(yōu)選的最佳工藝A1B1C3D1進(jìn)行試驗(yàn)，收膏率和丹參脂溶性有效部位的綜合評(píng)分值分別為0.9031，0.9029，0.8925。結(jié)果表明，驗(yàn)證試驗(yàn)各指標(biāo)性成分均處于較高水平，符合含丹參制劑的生產(chǎn)需要。

3 討論

3.1 優(yōu)選色譜條件 選取同時(shí)測定二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮ⅡA4種丹參脂溶性成分的色譜條件，主要考察流動(dòng)相：乙腈-0.02%磷酸溶液，乙腈-0.026%磷酸溶液，乙腈-0.03%磷酸溶液；梯度洗脫時(shí)間（0-20min，20%A→60%A，20-50min，60%A→80%A），（0-20min，20%A→60%A，20-80min，60%A→80%A），（0-20min，20%A→60%A，20-120min，60%A→80%A），（0-20min，20%A→60%A，20-120min，60%A→75%A）；以及流速：0.8，0.9，1.0 mL/min。結(jié)果流動(dòng)相A為乙腈-B為0.03%磷酸溶液，梯度洗脫（0-20min，20%A→60%A，20-120min，60%A→75%A），流速1.0 mL/min所得的色譜圖隱丹參酮，丹參酮I的分離效果最佳。

3.2 優(yōu)選提取因素 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，丹參滲漉工藝大多以丹參酮ⅡA為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，優(yōu)選出的乙醇濃度有90%，95%，與課題組進(jìn)行乙醇濃度因素篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，乙醇濃度越高，脂溶性成分丹參酮類越多，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要，我們把乙醇濃度定為95%。以二氫丹參酮I，隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮ⅡA4種丹參脂溶性成分的量及干浸膏收率為指標(biāo)優(yōu)選工藝，4倍乙醇用量有別于以往文獻(xiàn)報(bào)道乙醇用量（10倍，12倍，16倍），可為提取丹參脂溶性成分節(jié)約成本。

3.3 樣品處理 有效成分的測定收集滲漉液用相應(yīng)溶劑定容后直接進(jìn)樣，避免了揮干乙醇后再加甲醇溶解定容其間的系統(tǒng)誤差或溫度對(duì)丹參酮類有效成分的破壞，增加了測定的準(zhǔn)確性。

3.4 結(jié)論 課題組通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)相結(jié)合，逐級(jí)優(yōu)化提取條件，提出丹參滲漉的最佳工藝為丹參粗粉（過3號(hào)篩）加入4倍量，乙醇濃度95%，浸泡48h，滲漉速度為每分鐘1 mL·min-1，可作為提取丹參脂溶性成分提供參考。

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