檀碧波，李勇，趙群，范立僑，趙雪峰

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤，治療效果不理想、預(yù)后差。在胃癌進(jìn)展過(guò)程中，胃癌細(xì)胞由于具有較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，使胃癌細(xì)胞不易死亡，是胃癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的重要原因。在胃癌的凋亡抵抗形成過(guò)程中，多種分子組成的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控發(fā)揮了作用，探討關(guān)鍵分子在胃癌凋亡中的作用對(duì)闡明胃癌進(jìn)展機(jī)制、胃癌評(píng)價(jià)及治療思路的改進(jìn)有重要價(jià)值，但迄今相關(guān)的研究[1,2]還沒(méi)有突破性進(jìn)展。報(bào)道[3,4]顯示，微小RNA-218(miR-218)在胃癌細(xì)胞中表達(dá)降低，能調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，但有關(guān)miR-218與胃癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其預(yù)后價(jià)值分析的報(bào)道少見(jiàn)。本研究對(duì)胃癌組織中miR-218和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、x染色體連鎖凋亡抑制因子(xIAP)、生存素(Survivin)的表達(dá)水平及相關(guān)性進(jìn)行了觀察，分析miR-218表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，探討miR-218作為胃癌預(yù)后標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月～2012年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院接受手術(shù)治療的胃癌患者80例，其中男55例、女25例，年齡38～78歲，中位年齡60歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②確診為胃癌，手術(shù)切除了原發(fā)腫瘤；③患者手術(shù)前未接受放化療或靶向治療等針對(duì)腫瘤的治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤或嚴(yán)重的免疫或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；②復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者。手術(shù)過(guò)程中留取癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣>3 cm)，癌組織均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為胃癌，癌旁組織均經(jīng)病理檢查為胃黏膜組織，無(wú)癌及不典型增生組織?；颊呔型暾牟v記錄及隨訪資料，隨訪截止日期2017年1月。

1.2 基因引物、試劑與儀器 miR-218及Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin基因和內(nèi)參基因(U6、GAPDH)的引物序列由上海生工生物公司合成。TaqMan Real-Time PCR試劑盒為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品。PCR試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Invirtogen公司產(chǎn)品。Real-Time PCR儀(AB-7900型)為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 受檢組織中miR-218和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA檢測(cè)方法 受檢組織加入TRIzol試劑提取總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度。測(cè)定完畢后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成各靶基因的cDNA單鏈，然后取2 μL的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。按TaqMan Real-Time PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以U6為內(nèi)參，檢測(cè)miR-218的表達(dá)；按PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA的表達(dá)。引物序列如下：Bcl-2上游引物為5′- TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3′,下游引物為5′- TGGATCCAGGTGTGCAGGT -3′；Bax上游引物為5′- TTTCTGACGGCAACTTCAAC -3′,下游引物為5′- AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′；xIAP上游引物為5′- CCGTGCGGTGCTTTAGTTGT -3′,下游引物為5′- TTCCTCGGGTATATGGTGTCTGAT -3′；Survivin上游引物為5′- GCCAGATTTGAATCGCGGGA -3′,下游引物為5′- GCAGTGGATGAAGCCAGCCT -3′；GAPDH上游引物為5′- GACCCCTTCATTGACCTCAAC -3′,下游引物為5′- CGCTCCTGGAAGATGGTGAT -3′；U6上游引物為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA3 -3′,下游引物為5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT3 -3′。建立20 μL的PCR反應(yīng)體系，包括10 μL miRcute miRNA Premix(檢測(cè)miR-218)或SYBR Green Mix(檢測(cè)Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin)、上下游引物各0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、DEPC處理水7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸32 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt表示受檢組織中miR-218或Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以miR-218或Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量與內(nèi)參U6或GAPDH的相對(duì)表達(dá)量的比值代表目的分子的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。以胃癌組織中miR-218相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度的平均值為界，將胃癌患者分為miR-218高表達(dá)組與miR-218低表達(dá)組，對(duì)比分析其臨床病理參數(shù)及預(yù)后。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、癌旁組織中miR-218、Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度比較及其在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 胃癌組織中miR-218和Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin mRNA 的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為0.307 7±0.118 1、0.817 7±0.272 6、0.248 1±0.110 8、0.599 5±0.261 3、0.820 9±0.342 6，癌旁組織分別為0.565 9±0.226 0、0.277 4±0.116 7、0.444 4±0.201 9、0.298 7±0.147 8、0.247 0±0.112 2，兩種組織各指標(biāo)相比，P均<0.01。

胃癌組織中miR-218與Bcl-2 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.341,P<0.01)，miR-218與Bax mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.522,P<0.01)，Bcl-2 mRNA與Bax mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.439,P<0.01)，Bcl-2 mRNA與Survivin mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.235,P<0.01)。

2.2 胃癌組織中miR-218高低表達(dá)者臨床病理參數(shù)及預(yù)后比較 80例胃癌患者中，胃癌組織中miR-218高表達(dá)組42例、低表達(dá)組38例。在42例胃癌組織miR-218高表達(dá)組患者中，男26例、女16例，年齡≥60歲25例、<60歲17例，腫瘤直徑≥5 cm 23例、<5 cm 19例，漿膜內(nèi)浸潤(rùn)15例、漿膜外浸潤(rùn)27例，TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期21例、Ⅲ期+Ⅳ期21例，中高分化26例、低分化16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者5例。在38例胃癌組織miR-218低表達(dá)組患者中，男29例、女9例，年齡≥60歲16例、<60歲22例，腫瘤直徑≥5 cm 26例、<5 cm 12例，漿膜內(nèi)浸潤(rùn)18例、漿膜外浸潤(rùn)20例，TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期9例、Ⅲ期+Ⅳ期29例，中高分化22例、低分化16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者3例。對(duì)比兩組患者的臨床病理參數(shù)，結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-218的高低表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

胃癌組織中miR-218高表達(dá)組、低表達(dá)組的5年生存率分別為66.67%、28.95%，兩組相比，χ2=9.789，P<0.01。

3 討論

胃癌的發(fā)病率、死亡率在我國(guó)居各種惡性腫瘤的前列，該病起病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差，患者就診時(shí)大多已處于進(jìn)展期，綜合治療效果不理想[5,6]。胃癌進(jìn)展快的原因在于胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力、侵襲遷移能力及凋亡抵抗能力，使胃癌易于進(jìn)展及轉(zhuǎn)移,其中胃癌細(xì)胞的凋亡抵抗能力發(fā)揮了重要作用[7]。凋亡抵抗能力使胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的生存能力，且可以影響以誘導(dǎo)凋亡為作用機(jī)制的化療藥物的效果[8]。胃癌凋亡抵抗的能力是由多種基因共同作用而形成的，如能通過(guò)分子調(diào)控減輕胃癌細(xì)胞的凋亡抵抗能力，則有可能改善胃癌的綜合治療效果，從而改善患者的預(yù)后。在胃癌的分子調(diào)控過(guò)程中，近年來(lái)miRNA已受到越來(lái)越多的關(guān)注，并在胃癌研究中取得了很多成果。miRNA的作用極為廣泛，參與了生物體的各種生命現(xiàn)象，如發(fā)育﹑細(xì)胞分化﹑增殖和凋亡等[9]。miRNA的作用在于它能調(diào)控成組的靶基因，因而與單個(gè)基因相比，miRNA具有更為強(qiáng)大的調(diào)控功能。研究[10]表明，miR-218在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，在胃癌中也存在表達(dá)降低，并與胃癌的侵襲遷移有關(guān)，但有關(guān)miR-218與胃癌凋亡及其預(yù)后的報(bào)道少見(jiàn)。本研究顯示，胃癌組織中miR-218相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度明顯低于癌旁組織，miR-218相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-218低表達(dá)者的預(yù)后比高表達(dá)者差，提示miR-218可能作為預(yù)后因子對(duì)胃癌患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)價(jià)。

為分析miR-218的作用機(jī)制，本研究同時(shí)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA表達(dá)。Bcl-2是線粒體凋亡途徑的重要基因，可以通過(guò)改變線粒體的膜電位而抑制細(xì)胞凋亡，還可以通過(guò)改變線粒體膜的通透性將凋亡蛋白前體Apaf-1固定在線粒體膜上等機(jī)制而抑制細(xì)胞凋亡[11]。Bax則是促凋亡基因，可與Bcl-2結(jié)合成二聚體，通過(guò)二者的比例變化而影響細(xì)胞的凋亡[12]。xIAP、Survivin都是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成員，都具有較強(qiáng)的凋亡抑制作用，可以通過(guò)抑制半胱天冬酶的活性而發(fā)揮作用[13]。本研究顯示，胃癌組織中Bcl-2、xIAP、Survivin的mRNA均高于癌旁正常組織，而B(niǎo)ax 表達(dá)則低于癌旁正常組織，與相關(guān)報(bào)道一致[14～16]。相關(guān)分析顯示，miR-218與Bcl-2表達(dá)存負(fù)相關(guān)關(guān)系，miR-218與Bax表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，Bcl-2與Bax表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，Bcl-2與Survivin表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，這些結(jié)果提示miR-218可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2而發(fā)揮了作用，但具體情況還有待體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)胃癌組織中miR-218低表達(dá)，miR-218可能通過(guò)參與Bcl-2、Bax、Survivin基因表達(dá)的相互調(diào)節(jié)而參與腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程；胃癌組織中miR-218低表達(dá)預(yù)示腫瘤處于較高臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性較大，且miR-218低表達(dá)是胃癌患者預(yù)后差的重要標(biāo)志。