楊秀麗，楊麗萍，寧東賢，趙玉坤，李 楠

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000）

花生是我國重要油料作物之一，種植面積近466.7萬hm2，占全球的29%，總產(chǎn)居國內(nèi)五大油料作物之首。在我國，花生的消費主體是榨油，為了滿足市場對花生油的需求、提高花生食品品質(zhì)、延長貨架壽命，選育優(yōu)質(zhì)專用型花生成為花生育種的主要方向。

在我國，幾乎每年都有一些新育成的花生品種被推向市場，但絕大多數(shù)推廣品種的親本是“伏花生”和“獅頭企”，或者是含有它們的血緣[1]。優(yōu)勢新品種的選育決定于作物遺傳基因多樣性的豐富度，過多使用遺傳背景相同或相似的親本材料，會導(dǎo)致栽培種花生基因的大量流失，其遺傳基礎(chǔ)日益狹窄、遺傳變異率低，使得有性雜交重組中無法創(chuàng)造新的基因變異，優(yōu)異性狀的產(chǎn)生受到限制，無法獲得在農(nóng)藝性狀和品質(zhì)上突出的花生品種[2]。另外，花生是自花授粉作物，它的四倍體栽培種與其二倍體野生種之間存在的倍性差異以及遠緣雜交不親和性，阻礙了它們之間的基因交流，使得花生選育工作很難有突破性的進展[3]。因此，在花生遺傳育種工程中，需要一種有效方法來解決這些問題，創(chuàng)制出農(nóng)藝性狀優(yōu)良、適應(yīng)性強、配合力高和遺傳基礎(chǔ)廣泛的優(yōu)異新種質(zhì)。

化學(xué)誘變育種周期短、進程快、可以獲得大量的變異性狀，這些特點是常規(guī)育種所不具備的?；瘜W(xué)誘變育種利用誘變劑處理作物的花粉、種子、芽或莖稈等，發(fā)生誘變的后代產(chǎn)生可遺傳的變異，育種家根據(jù)育種目標，對突變體進行鑒定和篩選，最終選育出遺傳穩(wěn)定的新品系或新品種[4-5]。在作物育種中，常用的化學(xué)誘變劑有甲基磺酸乙酯（EMS）、疊氮化鈉（NaN3）和平陽霉素（PYM）。EMS是一種高效、穩(wěn)定和良好的化學(xué)誘變劑，目前在誘變育種中應(yīng)用最廣泛、效果也最好。

1 EMS誘變原理與特點

EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）分子式CH3SO2OC2H5，分子量124，無色液體，水中溶解度為8%，pH值7條件下在水中半衰期20℃時是93 h，30℃時26 h。EMS是一種烷化劑，它帶有1個或多個活性烷基，這些基團能夠轉(zhuǎn)移到一個電子密度高的分子上，置換堿基中的氫原子。EMS是通過與核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反應(yīng)來誘發(fā)突變的，當鳥嘌呤G的N-7位置被烷基化，成為一個帶正電荷的季銨集團，進而發(fā)生2種遺傳效應(yīng)：一是烷化的鳥嘌呤（G）與胸腺嘧啶（T）配對，代替胞嘧啶（C），發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變；二是由于N7烷基活化，糖苷鍵斷裂造成脫嘌呤，而后在DNA復(fù)制過程中，烷基化鳥嘌呤（G）與胸腺嘧啶（T）配對，導(dǎo)致堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，即原來的G∶C對可以變?yōu)槿魏螇A基對 G∶C，C∶G，A∶T，T∶A[6-7]。這種單一堿基對的改變形成了點突變。

EMS被認為是目前化學(xué)誘變效果最好而負面影響相對較少的誘變劑，它具備3個特性：一是高突變頻率和相對較少的染色體畸變，易于后代突變體的篩選；二是試驗材料受到的損傷相對較輕；三是EMS具有強烈的揮發(fā)性與致癌性[8]。

2 EMS誘變材料與方法

EMS誘變育種存在2個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一是選擇合適的供試材料；二是采用有效的處理方法。供試材料的不同將會引起誘變效率和后代篩選難度的不同，而有效的處理方法會在保證誘變劑高效滲入誘變部位的同時，作物的進一步生長和發(fā)育不會受到制約，最終產(chǎn)生突變個體，完成育種過程。

2.1 誘變材料

研究者通常根據(jù)作物的繁殖方式和染色體倍數(shù)來選擇誘變的部位，比如種子、花藥、花粉、塊莖和葉片等，一般農(nóng)作物的化學(xué)誘變最常用的供試材料是種子和花粉。誘變材料的處理途徑根據(jù)供試材料的不同有所差別，常用的途徑有浸泡法（種子、芽）、滴液法（莖）、注射法（花器）、涂抹法（花絲、莖）和共培養(yǎng)法（根、花藥）等。EMS誘變花生通常用種子作為供試材料，也有將EMS直接注入花生花器或涂抹果針的方法來獲得誘變體。SIVARAM等[9-10]用EMS處理花生種子，均選育出高產(chǎn)品系。FANG等[11]通過EMS誘變處理花生種子，篩選出了1個油酸含量高達60%以上的弗吉尼亞型花生突變體e2-4-83-12。殷冬梅等[12]選擇一片子葉但保留完整的花生胚作為種子外植體進行EMS誘變，確定了不同品種的適宜誘變組合。王傳堂等[13]將EMS直接注入花生開放花朵的龍骨瓣內(nèi)，獲得了超大果和超小果的突變體，種子的蛋白質(zhì)含量和粗脂肪含量有明顯提高。魯花12號是用EMS處理雜交組合的F1果針誘變育成的[14]。

2.2 誘變方法

構(gòu)建花生突變體庫中，要獲得良好的誘變效果，操作者除了選擇合適的誘變材料外，更重要的是選用適宜的誘變劑量（誘變劑量＝誘變液濃度×處理時間），最佳誘變劑量取決于EMS誘變濃度和處理時間的組合。此外，溫度和pH值對誘變效應(yīng)也有影響。

花生栽培種具有4種基因型，分別是普通型、珍珠豆型、多粒型和龍生型。育種家已經(jīng)對前3種類型進行了一些化學(xué)誘變的研究，結(jié)果表明，不同的基因型對誘變劑的響應(yīng)是存在差異的，在半致死量的條件下，不同基因型的誘變劑量是不一致的。一般情況下，隨著EMS溶液濃度的提高，誘變率相對增加，而對供試材料產(chǎn)生的生物學(xué)損傷也隨之變大，因此，在選擇誘變濃度時，既要能達到比較豐富的變異，又不致于對材料損傷過大。另外，誘變處理的時間越長，EMS在材料中的滲透程度越高，造成的生理損傷程度也相應(yīng)越強，而適宜的處理時間使受處理組織完全水合和被誘變劑浸透，因此，對種子進行誘變時，可預(yù)先浸泡，使種子內(nèi)部的代謝和合成活躍起來，以縮短處理時間。

王允等[15]用5個EMS濃度（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）分別注入2份花生品系的龍骨瓣中，田間觀察發(fā)現(xiàn)，2份品系畸變率隨EMS濃度升高而增大。朱保葛等[10]用1個濃度（0.3%），3個處理時間（5，10，15 h）分別處理不同基因型的花生材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EMS誘導(dǎo)花生產(chǎn)生的突變頻率因基因型和持續(xù)處理時間的不同而不同，各基因型對EMS處理的誘變反應(yīng)不一致。殷冬梅等[12]、楊富軍等[16]均設(shè)置多個誘變組合，以半致死量為選擇條件，發(fā)現(xiàn)不同基因型品種對EMS的敏感性存在差異，篩選出各基因型品種的適宜誘變組合。

3 后代突變體的篩選鑒定方法

3.1 表型鑒定

誘變后代的突變體篩選是以誘變育種和基因功能研究為目的的，表型鑒定作為最常用的方法，要求必須有能遺傳的、相對于野生型有顯著差異的外觀性狀，其中也包括逆境篩選和化驗分析篩選[17]。表型鑒定是基于作物的表型性狀數(shù)據(jù)做出的分析鑒定。表型性狀數(shù)據(jù)就是作物的形態(tài)特征數(shù)據(jù)，以花生為例，包括數(shù)量性狀（主莖高、側(cè)枝長、有效枝長、總分枝數(shù)、單株結(jié)果數(shù)等）和質(zhì)量性狀（葉型、葉色、株型、分枝型、花色、莖枝茸毛等）的數(shù)據(jù)。

表型性狀是基因型、環(huán)境以及基因型與環(huán)境互作效應(yīng)的綜合表現(xiàn)，是可以直接觀測的[18]。作物的一個表型可能由單個基因控制，也可能由多個基因控制，而作物的多個表型可能由多個基因控制，也可能由單個基因控制，由于表型和基因間的復(fù)雜關(guān)系，大多數(shù)的突變有多個突變表型。另外，數(shù)量性狀受外部環(huán)境條件影響頗大，在突變體的篩選中，需要通過多代的田間觀測鑒定來避免這一因素的影響[19]。

王傳堂等[13]在田間觀察2個花生誘變材料的后代，發(fā)現(xiàn)了果多果飽和表現(xiàn)特優(yōu)的品系，從而獲得了單株結(jié)果數(shù)、單株仁質(zhì)量、飽果率比野生型明顯提高的突變體。朱保葛等[10]在花生M2中統(tǒng)計出13種表型性狀突變類型，對6個產(chǎn)量性狀連續(xù)3 a進行了篩選對比和分析，得到了花生高產(chǎn)突變品系。

經(jīng)過誘變的花生通過田間觀察后代的表型性狀，發(fā)現(xiàn)不同表型的突變體，經(jīng)過篩選和鑒定，獲得突出的目的性狀，是誘變育種的理想結(jié)果，整個過程操作簡便、成本低，但是費時費力，容易遺漏一些變異性狀。

3.2 分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)方法是從分子水平來分析和比較DNA的堿基序列，挖掘突變體，確定突變頻率，它可以在早期鑒定植株是否發(fā)生遺傳變異，這種方法也稱為DNA分子標記。分子標記用于鑒定突變體的優(yōu)點在于突變位點以DNA形式表現(xiàn)，在植株的各個組織、各生育時期均可檢測到，不受外部環(huán)境的干擾。目前，常用的分子標記檢測方法有RELP，RAPD，SSR，AFLP，CAPS和基于單個核苷酸多態(tài)性的DNA標記等。殷冬梅等[12]使用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分子標記技術(shù)對不同的突變體進行了檢測，找到了EMS誘變花生的突變位點，從分子水平上為突變的產(chǎn)生提供了有力的依據(jù)。房超琦[20]在分子水平上研究了高油酸突變體E-2-4-83-12的FAD2B基因編碼區(qū)的堿基對發(fā)生了突變。

近年來，定向誘導(dǎo)基因組局部突變（targeting induced local lesions in genomes，TILLING）技術(shù)提供了從分子水平上定向規(guī)?；Y選突變體的技術(shù)平臺，它是基于反向遺傳學(xué)策略，將EMS誘變、PCR定向篩選和高通量檢測方法相結(jié)合，它可以高通量、快速準確地篩選出由EMS誘變產(chǎn)生的單核苷酸多態(tài)性（SNPS,single nucleotide polymorphisms）和INDELS[21-22]。TILLING 技術(shù)的主要流程是：（1）EMS誘變種子，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列點突變；（2）單株種植M1；（3）產(chǎn)生 M2種子；（4）提取 M2單株的 DNA，存放于96孔微滴定板中，收獲且保存M3種子，形成種子庫；（5）構(gòu)建DNA池；（6）設(shè)計特異性引物，PCR擴增大量的目標分析區(qū)域；（7）變性、退火，獲得野生型和突變型發(fā)生錯配的異源雙鏈核酸分子；（8）酶切異源雙鏈核酸分子，產(chǎn)物變性，進行凝膠電泳檢測；（9）篩選突變子；（10）使用相同的方法在8倍庫中找到突變單株[23]。目前，TILLING技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、大豆、水稻、大麥、擬南芥等20多種作物[24]，檢測出大量目標基因變異位點，獲得了多個不同類型的突變體，由此建立了相應(yīng)的突變體庫，為育種提供新的材料和種質(zhì)。

目前EMS誘變花生產(chǎn)生的突變體后代，其篩選主要依靠表型鑒定，但存在EMS誘發(fā)產(chǎn)生的一系列點突變難以鑒定的問題，而TILLING技術(shù)實現(xiàn)了高頻率點突變與PCR篩選技術(shù)的有效結(jié)合，這樣既可以獲得點突變的等位基因，又可在小范圍突變?nèi)后w內(nèi)篩選到目標基因的突變體。雖然在EMS誘變花生的研究中尚沒提到利用TILLING技術(shù)來規(guī)?；Y選突變體的報道，但是隨著花生基因組序列的完成和公布，TILLING技術(shù)將很快被應(yīng)用到其中。

4 應(yīng)用前景

EMS誘變在作物育種中的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，育種家通過化學(xué)誘變的方法，隨機改變遺傳信息，利用正向遺傳學(xué)原理，從表型數(shù)據(jù)入手，獲得優(yōu)異突變體，或者依據(jù)反向遺傳學(xué)策略，檢測出基因突變位點，建立相應(yīng)的突變體庫。無論哪種篩選方法，育種家總會獲得一些優(yōu)異突變體作為下一步選育或雜合的材料，最終選育出優(yōu)異品種。我國擁有近7 000份的花生種質(zhì)資源，包括栽培種和野生種，種質(zhì)類型豐富，具備高油、高蛋白、高油酸以及抗逆、抗病等優(yōu)異性狀的種質(zhì)材料很多，遺傳多樣性相對豐富[25]，但是，目前市場上大部分主推品種遺傳血緣相近，如果利用化學(xué)誘變來改變花生種質(zhì)的遺傳信息，建立不同類型的突變體庫，從中選擇優(yōu)異種質(zhì)資源或中間材料，將為花生育種開辟一條更加廣闊的天地。