蘇曉芳 董航明 蔡紹曦

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，慢性氣道疾病實(shí)驗(yàn)室（廣州 510515）

眾所周知，感染是許多慢性呼吸道疾病急性發(fā)作的重要因素，其中細(xì)菌感染占絕大多數(shù)［1］，部分與病毒性感染有關(guān)［2］。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)是利用特定的培養(yǎng)基只能培養(yǎng)特定以及常見的病原體，使我們對(duì)呼吸道微生物的認(rèn)識(shí)非常局限。過去的數(shù)十年里，人們一直認(rèn)為健康人的下呼吸道是無菌的，且認(rèn)為慢性呼吸道疾?。╟hronic respiratory disease，CRD）的急性發(fā)作主要是致病菌所致。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，尤其是二代測序技術(shù)在微生物組學(xué)研究的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)健康人下呼吸道同樣存在微生物菌群，并且提出了真菌菌群平衡與失調(diào)的觀念。認(rèn)為人類健康與疾病也同真菌菌群的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)［3］，而不僅僅是常見幾種包括流感嗜血桿菌、莫拉氏菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌等病原菌［4］導(dǎo)致急性發(fā)作及病情進(jìn)展。目前許多呼吸道微生物組學(xué)研究主要集中在細(xì)菌菌群，而對(duì)于真菌菌群以及病毒的研究都較為缺乏，尤其是真菌微生物組與CRD的相關(guān)研究。本文就真菌微生物組與慢性呼吸道疾病的關(guān)系及微生態(tài)平衡與失調(diào)、二代測序在真菌微生物組學(xué)中的應(yīng)用做一綜述。

1 呼吸道真菌微生物組與慢性呼吸道疾病

真菌及真菌孢子可存在于人類的皮膚、黏膜、口腔、消化道、肺部等［5］，一些直徑＜2～3μm的真菌以及真菌孢子可被吸入至終末支氣管甚至是肺泡內(nèi)。而真菌病原學(xué)特性與人體局部免疫反應(yīng)則決定著這些微生物是附著/定植于或被清除出呼吸道，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生及進(jìn)展［6-7］。真菌感染是威脅人類健康的一大疾病，尤其是肺部真菌感染，致死性高，嚴(yán)重威脅公共健康及患者生命。但是，真菌感染的診治有時(shí)卻讓人束手無策，目前最常見且臨床上能培養(yǎng)到的仍是念珠菌以及曲霉菌兩大類［8］。同時(shí)，已有研究不僅表明了真菌與CRD之間的關(guān)系，還發(fā)現(xiàn)呼吸道真菌與CRD預(yù)后有關(guān)，也可導(dǎo)致肺功能的減退［9］。更有研究發(fā)現(xiàn)使用廣譜抗生素影響真菌與細(xì)菌之間微生態(tài)平衡，導(dǎo)致呼吸道真菌感染的發(fā)生以及病原體對(duì)抗真菌藥產(chǎn)生耐藥［10］。臨床上面臨的種種挑戰(zhàn)，讓我們迫切需要一種新方法更準(zhǔn)確、快速地輔助臨床診療。雖然傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是真菌感染一種重要的診斷方法，但是它在鑒別混合感染以及分析菌群群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化非常有限。據(jù)我們所知，基于常規(guī)的培養(yǎng)方法，很多真菌或者未被發(fā)現(xiàn)的新菌種，很難甚至無法被培養(yǎng)出來［11］。二代測序技術(shù)無論從檢測深度及廣度，亦或分析菌群群落結(jié)構(gòu)特征，明顯優(yōu)于培養(yǎng)技術(shù)。目前使用二代測序研究肺部真菌與CRD的關(guān)系并不多，過去的研究報(bào)道主要見于囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）、哮喘以及慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive disease，COPD）等。有些研究也發(fā)現(xiàn)在健康人的下呼吸道可檢測到少量的真菌微生物存在，主要是一些條件致病菌如曲霉菌和枝孢菌屬；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)健康人下呼吸道真菌微生物組與上呼吸道的有差別，如口咽部真菌菌群是以念珠菌屬為主［12］。

對(duì)于CRD患者呼吸道真菌菌群也明顯與健康人的不同，其中研究最多的是CF患者。利用培養(yǎng)技術(shù)很容易檢測到CF呼吸道定植真菌菌群，超過50%患者可找到曲霉菌及念珠菌［13］；但是它們?cè)贑F病情進(jìn)展過程所起的作用存在爭議。有些研究發(fā)現(xiàn)，CF患者呼吸道真菌負(fù)荷量增加而菌群α多樣性是減少的，真菌可導(dǎo)致肺功能減退，這可能與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，其中念珠菌屬與曲霉菌屬更是與CF的發(fā)病率密切相關(guān)［14］。近年來，少數(shù)研究利用二代測序技術(shù)，可檢測到更為豐富的真菌菌群。據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用454FLX方法檢測到的真菌菌群，超過60%的種屬是培養(yǎng)技術(shù)無法檢測到［14］。即使目前各個(gè)研究結(jié)果有所差異，但共同一致的是念珠菌屬豐度是最高的［14-15］。真菌可導(dǎo)致肺功能減退，影響疾病預(yù)后，而測序技術(shù)有助于從群落整體結(jié)構(gòu)了解氣道微生物的全貌以進(jìn)一步輔助疾病的診療。

同樣地，研究也發(fā)現(xiàn)真菌與哮喘的嚴(yán)重程度關(guān)系密切［12］，重癥哮喘患者相對(duì)于輕度者、哮喘患者相對(duì)于健康人群、使用激素者相對(duì)于未使用激素者，呼吸道真菌負(fù)荷量增多［16］，其中曲霉菌的相對(duì)豐度最高。哮喘患者痰液中馬拉色菌屬，Psathyrella candolleana，Termitomyces clypeatus和Grifola sordulenta菌群豐度比健康對(duì)照組的高；而Eremothecium sinecaudum，Systenostrema alba，Cladosporium cladosporioides和Vanderwaltozyma polyspora在健康對(duì)照組更為常見［12］。事實(shí)上，除了曲霉菌可引起變態(tài)反應(yīng)性疾病如哮喘、ABPA等［16］，有些真菌如馬拉色菌屬也被認(rèn)為跟一些變態(tài)反應(yīng)性疾病相關(guān)，如特發(fā)性皮炎和慢性鼻竇炎［18-19］。甚至也有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可加重肺部炎癥，引起肺部變態(tài)反應(yīng)性疾?。?9-20］，如腸道念珠菌可在腸道產(chǎn)生PEG2酶到達(dá)肺部引起炎癥反應(yīng)［21］。目前對(duì)于真菌與哮喘之間的關(guān)系以描述性研究為主，而呼吸道真菌在哮喘的急性發(fā)作及發(fā)病機(jī)制等方面的研究仍處于初始階段，有待于深入探討。

真菌微生物組學(xué)研究在COPD上較為少見。2015年有一項(xiàng)隊(duì)列研究［22］，采集了56個(gè)研究對(duì)象（HIV、HIV合并COPD患者以及非HIV人群）的誘導(dǎo)痰（induced sputa，IS）、口腔灌洗液（oral washes，OW）以及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavages，BAL）。研究發(fā)現(xiàn)，在HIV合并COPD患者，肺孢子菌異常高表達(dá)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)念珠菌屬在OW標(biāo)本中更為豐富，而Ceriporia lacerata、Saccharomyces cerevisiae以及Penicillium brevicompactum則在BAL標(biāo)本中更為常見。并且研究表明HIV合并COPD與HIV肺功能正常者菌群結(jié)構(gòu)有所差異。在HIV合并COPD人群中，BAL中可發(fā)現(xiàn)12種真菌的豐度更高（Sebacina incrustans，Junghuhnia nitida，Pneumocystis jirovecii等），而Bullera setariae和Trametes hirsuta在HIV肺功能正常者菌群豐度較高?，F(xiàn)真菌微生物組學(xué)在COPD患者的研究比較缺乏，2015年該項(xiàng)隊(duì)列研究主要還是以HIV患者為研究對(duì)象，并沒有納入COPD非HIV患者。因此，真菌微生物組與COPD急性發(fā)作及疾病進(jìn)展的關(guān)系需要做進(jìn)一步研究。同時(shí)COPD患者用藥（如吸入激素、支氣管擴(kuò)張劑、抗生素等）對(duì)呼吸道真菌群落的影響還未明確，該方面研究尚缺乏但臨床意義重大，值得進(jìn)一步探索。

2 腸道真菌微生物組與慢性呼吸道疾病

腸道菌群與腸道外疾病的關(guān)聯(lián)研究越來越多，包括肺部疾病如哮喘、神經(jīng)精神疾病如帕金森病、糖尿病、高血壓病、肥胖等［23］；近些年提出了腸-肺軸，講述了腸道菌群與呼吸道菌群的相互作用［24］以及對(duì)疾病的影響。而腸道真菌菌群與肺部疾病的相關(guān)研究目前也不乏少數(shù)。早期提出的衛(wèi)生學(xué)假說，認(rèn)為嬰幼兒期對(duì)微生物病原體的接觸減少后，此后過敏性疾病的發(fā)病率將大大增高［25］。有研究表明在抗生素治療后或無菌小鼠模型上，過敏性疾病發(fā)病率增加，且發(fā)現(xiàn)與缺乏微生物免疫相關(guān)的Th2有所關(guān)聯(lián)［25］。但現(xiàn)在更多的研究是，關(guān)于腸道微生態(tài)平衡與失調(diào)跟疾病的關(guān)系，如炎癥性腸?。?7］、腸易激綜合征、哮喘、CF等。如腸道菌群失調(diào)可增加呼吸道過敏性疾病的急性發(fā)作次數(shù)，尤其是念珠菌屬減少而曲霉菌屬、Wallemia及Epicoccum增加［20］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在新生兒期腸道念珠菌和Rodotorula與哮喘的發(fā)病率增加相關(guān)，但是該機(jī)制尚未明確［27］。實(shí)際上也有研究利用哮喘模型小鼠，抗真菌治療后腸道真菌菌群變異或者念珠菌屬移植腸道后，可加重呼吸道炎癥反應(yīng)［19-20］；同時(shí)伴隨著嗜酸細(xì)胞、肥大細(xì)胞、IL-3、IL-5、IFNγ以及IgE水平增高［19］。其中一項(xiàng)研究表明，腸道念珠菌通過產(chǎn)生一種PEG2酶作用于肺部后影響巨噬細(xì)胞導(dǎo)致呼吸道過敏性疾病的急性發(fā)作及加重［21］。其實(shí)，腸道菌群通常也反映口腔菌群菌落結(jié)構(gòu)，而同時(shí)口腔菌群又直接影響呼吸道菌群，也與宿主微生物免疫相關(guān)。因此，口腔菌群、呼吸道菌群以及腸道菌群相互影響、相互作用，三者的研究都不可或缺。綜上所述，腸道真菌菌群與呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展也有關(guān)聯(lián)，但其機(jī)制尚未明確，還需深入研究。

3 真菌菌群微生態(tài)平衡與失調(diào)

真菌在我們的生存環(huán)境中是無處不在的，它在物種進(jìn)化史扮演著重要的角色［28］，與人類有著千絲萬縷的聯(lián)系，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有著巨大影響［29］，而免疫系統(tǒng)則維持著細(xì)菌、真菌與宿主之間的互利共生、共同進(jìn)化的平衡關(guān)系。微生態(tài)失調(diào)首先在腸道細(xì)菌菌群上提出的，甚至認(rèn)為可能是一些疾病的病因。但現(xiàn)在更多地認(rèn)可真菌菌群失調(diào)在人類疾病發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要的作用。它有別于真菌感染［30］，可以說是真菌感染的誘因，也是真菌感染的結(jié)果，它描述的是真菌菌群的整體結(jié)構(gòu)特征。而我們的免疫系統(tǒng)則可識(shí)別共生真菌及致病真菌［3］，形成了一道天然的黏膜免疫屏障抵御真菌感染［31］。酵母科下的酵母屬和念珠菌屬、曲霉菌屬、鐮孢屬、枝孢屬以及馬拉色菌屬歸于共生真菌，它們?cè)谝欢l件下可導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至在免疫功能缺陷者可引起菌血癥。其中一些共生真菌參與維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，如布拉酵母菌，則可預(yù)防廣譜抗生素使用后艱難梭菌的感染以及減輕腹瀉癥狀［32］。其機(jī)制是酵母菌可產(chǎn)生蛋白酶和磷酸酶，從而使艱難梭菌和大腸桿菌產(chǎn)生的毒素失活，而且它可限制白色念珠菌和沙門氏菌［33］。因此，除外真菌感染，還有真菌失調(diào)在我們臨床診治上也同樣有著重要的作用，需要臨床醫(yī)護(hù)人員以及研究者的關(guān)注以及進(jìn)一步探索。

4 二代測序與真菌微生物組學(xué)研究

二代測序技術(shù)在微生物組學(xué)應(yīng)用越來越廣泛，測序技術(shù)主要包括了宏基因組學(xué)和菌群結(jié)構(gòu)譜。其中，真菌菌群結(jié)構(gòu)譜方法主要是通過對(duì)真菌ITS1（internal transcribed spacer）和ITS2基因片段進(jìn)行擴(kuò)增、測序、分析，也可以稱作ITS1/ITS2基因測序技術(shù)。

真菌不同于細(xì)菌的結(jié)構(gòu)特征是真菌有一層厚厚的細(xì)胞壁，因此，細(xì)菌DNA提取方法并不一定適用于真菌。真菌有自己獨(dú)特的DNA提取和PCR擴(kuò)增的方法，而且不同的真菌DNA檢測方法可能會(huì)產(chǎn)生不一樣的結(jié)果。雖然，全基因組測序鳥槍法產(chǎn)生偏差最小，但它所要求的測序深度要絕對(duì)足夠完成全部測序序列的檢測。利用該方法檢測人類糞便標(biāo)本時(shí)，只能檢測識(shí)別到5種真菌，包含6.5×1011堿基［34］。而利用真菌特異性檢測方法，如ITS1/ITS2基因測序，可檢測到50～60個(gè)菌屬［35］。該真菌特異性檢測方法是對(duì)真菌rDNA的ITS1/ITS2基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序分析。因?yàn)椴煌腜CR引物可以靶向不同的真菌ITS基因，所以它可以更好地對(duì)真菌菌群進(jìn)行分類。而且測序所得到的真菌ITS基因序列可以通過現(xiàn)有的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹對(duì)，但對(duì)于新物種，則無法準(zhǔn)確地確定種類［36］。在Gene-Bank平臺(tái)上，還有許多真菌ITS測序序列被定義為“unidentified fungus”。還有一點(diǎn)需要說明的是，對(duì)于不同菌屬，ITS基因測序方法的識(shí)別度會(huì)有所差異。對(duì)于念珠菌屬以及曲霉菌屬，ITS基因測序可以很好地識(shí)別它們的ITS基因序列，并且可在種水平區(qū)分出一些病原菌菌株［37］。而對(duì)于有些菌屬如Cladosporium（枝孢屬）則無法更好地分類出其在種水平的菌株。因此，應(yīng)根據(jù)研究設(shè)計(jì)、研究對(duì)象以及研究目的，權(quán)衡利弊，選擇適合的真菌檢測方法。

5 總結(jié)

真菌在我們的生存環(huán)境是無處不在的，與人類健康和疾病狀態(tài)息息相關(guān)。真菌菌群的動(dòng)態(tài)平衡則對(duì)于維持免疫穩(wěn)態(tài)起著重要作用，并形成一道天然的黏膜免疫屏障保護(hù)機(jī)體。真菌存在于皮膚、口腔、腸道、呼吸道等部位，一部分真菌在一定條件下可致病，甚至導(dǎo)致菌血癥。而真菌微生物組學(xué)在呼吸道疾病研究比較少，未來仍有很大探索空間。近年來，二代測序技術(shù)的發(fā)展，使呼吸道微生物組學(xué)研究成為一個(gè)焦點(diǎn)并且研究內(nèi)容更為豐富和深入，為我們提供更為廣闊的研究視野以及研究前景，并在未來可能成為指導(dǎo)我們臨床疾病的診治的重要手段。

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