向大育，申紅春

（恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院 445000）

2017年5月，恩施自治州某規(guī)模化雞場45日齡左右的海蘭褐蛋雞群開始出現(xiàn)死亡，表現(xiàn)為零星死亡，隨后死亡增加，日死亡率達2%，病雞精神沉郁，食欲差，雞冠蒼白，排拉紅色血便。采用雙黃連口服液和地克珠利治療，治療效果不佳。該雞場將患病蛋雞送檢恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院，剖檢見心包積液嚴(yán)重，肝臟黃黑相間。腎臟腫大、蒼白，有尿酸鹽沉積，盲腸內(nèi)充滿血液。

根據(jù)該雞群的發(fā)病史、臨床癥狀和剖檢變化，初步診斷疑似為球蟲與禽腺病毒I群混合感染。為了進一步確診，對送檢患病蛋雞進行了糞檢、PCR檢測和病毒分離等實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來源于恩施某雞場的患病雞，無菌剖檢采集肝臟、心包積液等組織，加入的無菌PBS溶液，研磨后，-20℃保存；糞便采集新鮮血便。

1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA凝膠回收試劑盒等材料購自上海生工工程股份有限公司（簡稱上海生工）。

1.3 儀器

PCR儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 糞便蟲卵檢查

取患病雞新鮮糞便適量，加入飽和食鹽水50mL，攪拌后使用60目篩網(wǎng)過濾。將過濾液按照3000r/min離心10min，棄上清液，沉渣再加50mL飽和食鹽水，靜置25min，蘸取表層液體置于載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢。

1.4.2 病毒的檢測

無菌采集病死蛋雞的心包積液和肝臟，并提取組織總DNA和總RNA。以其為模板，分別進行FAdV-Ⅰ的常規(guī)PCR和RTPCR擴增。

禽腺病毒特異性引物參照文獻中Ⅰ亞群的禽腺病毒Hexon基因合成引物，擴增片段為500bp，上游引物F：5'-AATTTCGACCCCATGACGCGCCCAGG-3'，下游引物R：5'-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3'。

本實驗檢測引物均由上海生工合成。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送上海生工測定基因序列。

2 結(jié)果

2.1 病雞的眼觀病變

患病蛋雞心包積液嚴(yán)重，心包中可見到大量的淡黃色的清亮液體，肝臟腫大，出血，質(zhì)地脆弱易破裂，表面凹凸不平，壞死灶和出血交替出現(xiàn)，呈現(xiàn)黃黑相間。腎臟腫大、蒼白，有尿酸鹽沉積，盲腸內(nèi)充滿血液。

2.2 糞便鏡檢結(jié)果

鏡檢可見一端稍尖，另一病料樣品孔與心包中液體端鈍圓呈現(xiàn)橢圓形或卵圓形的球蟲卵囊。

2.3 病毒的檢測及測序分析

PCR電泳試驗結(jié)果見圖1，從圖中可以看出，本次試驗病料樣品與心包積液PCR擴增產(chǎn)物與預(yù)期擴增產(chǎn)物片段大小相符，試驗擴增產(chǎn)物的條帶處于508bp，基因測序結(jié)果與GenBank中的序列比對，并用DNAStar軟件同源性分析，結(jié)果為，分離株與禽腺病毒I群序列同源性為96.5%，表明病料樣品中含有禽腺病毒I群。

圖1 PCR擴增結(jié)果M：DL1 000 DNA Marker；1：組織樣品；2：心包積液；3：陽性對照；4：陰性對照

3 討論

禽腺病毒I群主要引起雞的包涵體肝炎、心包積水綜合征的特異性病原體，其主要病變特征為心包中有淡黃色水樣或膠凍樣的積液，心臟松弛、柔軟。肝臟呈現(xiàn)淡褐色和黃色，質(zhì)地變脆，出現(xiàn)充血、腫脹，伴有局灶性壞死點和出血點[1]。根據(jù)雞群的臨床癥狀、發(fā)病和病變特點、PCR檢測及目的基因測序結(jié)果，可以確診該雞群為FAdV-Ⅰ與球蟲混合感染。

心包積液綜合征首次發(fā)生于1987年的巴基斯坦安卡拉地區(qū)[2]，我國的相關(guān)心包積液綜合征報道較少。自2015年以來我國河南、遼寧、吉林、山東、河北陸續(xù)出現(xiàn)類似的疾病，并且呈現(xiàn)普發(fā)態(tài)勢，已經(jīng)為嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的一種傳染病[2]。當(dāng)前有學(xué)者對湖北各地區(qū)雞場中禽腺病毒I群感染進行報道，郭杰、羅玲分別從湖北省某雞場中心包積液綜合征病例中分離鑒定為禽腺病毒I群[3]；周偉、鄭成分別從武漢周邊發(fā)病雞場中分離出禽腺病毒I群[4]；蔡宇威報道從仙桃市某發(fā)病雞場分離出禽腺病毒I群[4]。而恩施自治州尚未見該病的報道，本次從恩施某雞場的獲得分離株與禽腺病毒I群序列同源性為96.5%，表明在恩施地區(qū)該疾病已經(jīng)流行。

此外，文獻報道禽腺病毒I群一個條件致病性病毒，廣泛存在于家禽的呼吸道和消化道，其發(fā)病往往伴隨著其他不良因素如通風(fēng)不良、飼料霉菌毒素超標(biāo)；或者其他疾病如IBD、CIAV、H9N2、NDV的發(fā)生。因此，在飼養(yǎng)過程中要注重家禽飼養(yǎng)管理，提高雞體免疫功能，同時加強禽舍中的環(huán)境衛(wèi)生，加強通風(fēng)，合理消毒，并做好IBD、CIAV等疾病的免疫工作，減少心包積液綜合征。在治療過程中，使用卵黃抗體，并結(jié)合保肝護腎的藥物進行治療，減少家禽的死亡，降低養(yǎng)殖經(jīng)濟損失。