楊紅梅，田春林，梁燕妮，卓梅芳，陳超杰，陳小敏

(1.2.3.4.5.6.梧州學(xué)院，廣西 梧州 543002)

桑寄生的主要功效是祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，主要成分為黃酮類化合物，其中槲皮素含量最高，槲皮素作為藥物具有抗自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[1]。超聲輔助提取法是指利用超聲波對植物細(xì)胞進(jìn)行破壞，加速溶劑浸入和有效成分溶出的樣品前處理方法，與傳統(tǒng)的回流提取、浸漬提取等相比，超聲輔助提取法具有提取率高、用時(shí)短和防止有效成分熱分解等優(yōu)勢[2]，已廣泛用于中藥材中黃酮類、皂苷類、生物堿等活性成分的提取[3]。

《中國藥典》(2015版)桑寄生中槲皮素采用回流法提取，此方法在中藥提取中應(yīng)用較多，但存在耗時(shí)長、提取率低、破壞活性成分等缺點(diǎn)。本研究采用超聲輔助法提取梧州桑寄生茶中的槲皮素，分別在提取和水解階段設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，確定超聲提取最優(yōu)條件，結(jié)果顯示超聲提取效率高于回流提取。

1 材料與試劑

高效液相色譜儀(安捷倫1290 Infinity，島津)；高速冷凍離心機(jī)(塞默飛世爾科技有限公司，Multifuge X3R)；智能型液晶數(shù)控型超聲波清洗機(jī)(威固特新型設(shè)備有限公司，型號：KM-1990QFY)；200克手提式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司，型號：DFT-200)；電子分析天平(SARTORIUS賽多利斯經(jīng)濟(jì)型精密天平GL2202-1SCN)。

甲醇為色譜純，超純水，無水乙醇、磷酸、鹽酸、甲酸乙酯、甲苯等均為分析純，槲皮素(中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-201506)，梧州桑寄生茶(產(chǎn)地：梧州)。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

稱取槲皮素對照品適量，共6份，分別置于25 mL容量瓶中，分別加入甲醇稀釋，微孔濾膜過濾，然后加甲醇至刻度，使之濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取恒重的寄生茶浸膏30 mg置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇溶液10 mL，超聲溶解浸膏，用70%的乙醇補(bǔ)足在超聲過程中減失的重量，再加入鹽酸溶液2mL，置于90℃的水浴上加熱1 h，將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.2 槲皮素分析方法的建立

2.2.1 色譜條件[4]

色譜柱C18填充材料柱Thermo Accucore(2.6μm，100 mm×2.1 mm)，甲醇、0.2%磷酸溶液(40：60)為流動(dòng)相，流速為0.3 mL/min，柱溫箱35℃，進(jìn)樣量2μL，紫外檢測波長360 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)2 μL，按步驟“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣，以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)X(μg)，峰面積為縱坐標(biāo)Y(mAU)，得到線性方程為Y=170.9X+0.1081，R2=0.9995。結(jié)果表明，槲皮素在0.04～0.24μg進(jìn)樣范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。線性關(guān)系見圖1。

2.2.3 分析誤差校驗(yàn)

分別按照精密度試驗(yàn)、待測液穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)要求進(jìn)行分析誤差校驗(yàn)，結(jié)果見下頁表1。

表1 分析誤差校驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證方法精密度試驗(yàn)穩(wěn)定性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)加樣回收試驗(yàn)RSD(%)1.42.02.11.6平均回收率(%)99.37

2.3 超聲輔助法提取槲皮素工藝優(yōu)化

2.3.1 提取階段優(yōu)化

超聲輔助提取法是應(yīng)用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，破壞植物藥材的細(xì)胞，使溶劑滲透到藥材細(xì)胞中，縮短提取時(shí)間，提高提取率。頻率、溶劑、時(shí)間、料液比和提取溫度是影響超聲輔助提取的重要因素，由于聲波頻率對提取的影響無法測定，因此，對溶劑，時(shí)間，料液比和提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，因素水平見表2。

表2 提取階段單因素試驗(yàn)因素和水平

水平因素溫度(℃)A乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)B時(shí)間(min)C料液比D12050201:1024070301:2036090401:30

2.3.2 水解階段優(yōu)化

水解過程采用鹽酸進(jìn)行，鹽酸相對于硫酸對儀器的損害較小。水解溫度、水解時(shí)間、加酸量對水解都有影響，從而影響提取物的含量。對水解溫度、水解時(shí)間、加酸量三個(gè)條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，因素水平見表3。

表3 水解階段單因素實(shí)驗(yàn)因素和水平

水平因素水解溫度(℃)A0水解時(shí)間(min)B0加酸量(mL)C0150300.50270601.00390901.50

2.4 樣品測定

取3個(gè)批次的梧州寄生茶，每個(gè)批次分別用超聲輔助法最優(yōu)工藝和回流法提取1次，比較槲皮素得率。

3 結(jié)果與分析

3.1 超聲輔助法提取槲皮素工藝優(yōu)化結(jié)果

3.1.1 提取階段優(yōu)化結(jié)果

取粉碎、篩分(過2號篩和4號篩)后的寄生茶粉末10.0 g，按表2的水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，樣品按步驟“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表4。

表4 提取階段單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)號溫度(℃)A乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)B時(shí)間(min)C料液比D含量(%)12050201:200.078924050201:200.108136050201:200.156446050201:200.154256070201:200.246366090201:200.073176050201:200.151986050301:200.185496050401:200.2041106050201:100.1768116050201:200.1549126050201:300.0953

由表4提取階段單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，不同提取溫度含量由高到低排列依次是A3>A2>A1，乙醇不同體積分?jǐn)?shù)含量由高到低排列依次是B2>B1>B3，不同提取時(shí)間含量由高到低排列依次是C3>C2>C1，不同料液比含量由高到低排列依次是D1>D2>D3。綜合考慮，超聲輔助提取的最優(yōu)方案為：A3B2C3D1，即提取溫度為60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時(shí)間為40min、料液比為1∶10。

3.1.2 水解階段優(yōu)化結(jié)果

按照最佳提取條件：溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間40 min、料液比1∶10，進(jìn)行超聲提取，提取物按表3的因素水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 水解階段單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)號水解溫度(℃)A0水解時(shí)間(min)B0加酸量(mL)C0含量(%)150601.000.2370270601.000.2669390601.000.2827490301.000.2968590601.000.2886690901.000.2795790600.500.2925890601.000.2810990601.500.2738

由表5水解階段單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，不同水解溫度含量由高到低排列依次是A03>A02>A01，不同水解時(shí)間含量由高到低排列依次是B01>B02>B03，不同加酸量含量由高到低排列依次是C01>C02>C03。綜合考慮，水解階段最優(yōu)方法為：A03B01C01，即水解溫度為90℃、水解時(shí)間為30 min、加酸量為0.5 mL。

3.1.3 方法驗(yàn)證

分別取粉碎、篩分(過2號篩和4號篩)后的寄生茶粉末6份，每份10.0 g，按優(yōu)化的提取工藝(A3B2C3D1)、水解方法(A03B01C01)制備供試品溶液，按步驟“2.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，測定槲皮素的含量。結(jié)果6個(gè)樣品槲皮素的含量比較均一，平均值為0.3112%。重現(xiàn)性試驗(yàn)RSD為1.8%，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.7%，回收試驗(yàn)RSD為0.6%，說明超聲輔助法提取槲皮素方法可行，且獲得的槲皮素24h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 樣品測定結(jié)果

取梧州桑寄生茶三個(gè)批次，每批次2份，每份約10.0 g。每批次的1份按照優(yōu)化后的超聲輔助法進(jìn)行提取和水解，另1份按藥典的回流法進(jìn)行提取，樣品按步驟“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表6。

表6 不同批號樣品測定結(jié)果

批號123平均超聲輔助提取槲皮素含量(%)0.3240.2900.2820.298回流提取槲皮素含量(%)0.2310.2080.2170.218

4 結(jié)論

采用超聲輔助法提取梧州桑寄生中的槲皮素平均值為0.298%，采用回流法提取梧州桑寄生中的槲皮素平均值為0.218%，且超聲輔助提取具有提取率高、用時(shí)短和防止有效成分熱分解等優(yōu)勢，所以提取梧州桑寄生中的槲皮素，超聲輔助提取法優(yōu)于回流法。