管志美，彭艷梅，王銀，王興國(guó)，彭宇，李躍輝*

南寶戒毒清膠囊系由湖南省中醫(yī)藥研究院和邵陽(yáng)市中醫(yī)解毒研究所聯(lián)合研發(fā)的新型毒品戒斷藥，自2010年以來(lái)，臨床應(yīng)用于毒品戒毒2500多例，療效確切。產(chǎn)品處方是由黃芪、遠(yuǎn)志、黨參、人參、柏子仁等二十一味中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有扶正固本，補(bǔ)氣安神，解痙止痛，鎮(zhèn)驚熄風(fēng)之功效，臨床適用于因吸食阿片類毒品或甲基苯丙胺類毒品有戒斷癥狀綜合癥狀者。本文擬采用Plackett-Burnman設(shè)計(jì)聯(lián)合Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)南寶戒毒清膠囊提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為后期產(chǎn)品的大生產(chǎn)及臨床應(yīng)用研究提供可行性依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent-1260高效液相色譜儀（ELSD-UM4800型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）；島津LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A檢測(cè)器，LC-20A泵，LC-20B泵）；色譜柱（依利特Hypersil ODS2 ，4.6mm×250mm，5μm）；HD-200型高速多功能粉碎機(jī)（諸暨市海道機(jī)械有限公司）；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋、101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AL204電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司），YP5102電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）。

黃芪、遠(yuǎn)志等藥材均購(gòu)于湖南省自然堂中藥飲片有限公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所鑒定室鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2015年版一部各藥材項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定；乙腈、甲醇（一級(jí)色譜純Honeywell Burdick & Jackson）；水為重蒸餾水；黃芪甲苷對(duì)照品、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201717、111849-201705，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；其他試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 浸膏得率的測(cè)定[1]

按處方比例稱取黃芪、遠(yuǎn)志等藥材共93.6 g，加水提取，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至一定體積。精密量取濃縮液適量，置己干燥至恒重的蒸發(fā)皿中蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重，計(jì)算浸膏得率。

2.2 黃芪甲苷的含量測(cè)定[2～3]

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1，流速為0.8 mL﹒min-1，柱溫：25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，蒸發(fā)溫度100 ℃，霧化溫度95 ℃，氣體流速為2.8 L﹒min-1，增益值為1.0。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.49 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取濃縮液適量蒸干，加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

2.3 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定[4～5]

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.05%磷酸溶液(72：28為流動(dòng)相，流速為1mL﹒min-1，柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。理論板數(shù)按細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的配制 取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.42 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取濃縮液適量蒸干，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，置圓底燒瓶中，蒸干，殘?jiān)?0%氫氧化鈉溶液50 mL，加熱回流2 h，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4～5，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

2. 4 Plackett-Burnman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主要影響因素

2.4.1 因素及水平[6]在實(shí)際大生產(chǎn)中，影響提取工藝的因素包括藥材粒度、提取次數(shù)、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取溶劑及溶劑用量等，本課題在前期的初步研究中采用了水提，確定了溶劑種類。故現(xiàn)以黃芪甲苷提取量（mg）和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷提取量（mg）作為考察指標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert8.0.5.軟件進(jìn)行Plackett-Burnman設(shè)計(jì)，對(duì)藥材粒度、提取次數(shù)、浸泡時(shí)間、溶劑用量、提取時(shí)間進(jìn)行考察。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果設(shè)每個(gè)因素高低2水平，用1、-1表示。因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Plackett-Burnman設(shè)計(jì)因素水平表

表3 Plackett-Burnman設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排及結(jié)果

2.4.2 模型的建立及分析 運(yùn)用Design-Expert8.0.5.軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合、回歸分析和F檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Plackett-Burnman設(shè)計(jì)模型方差分析

由表4可知，模型顯著；X2/提取次數(shù)、X4/溶劑用量、X5/提取時(shí)間對(duì)黃芪甲苷和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的提取量影響均顯著；各顯著性影響因素大小順序?yàn)閄4/溶劑用量＞X5/提取時(shí)間＞X2/提取次數(shù)，其他兩個(gè)因素包括藥材粒度、浸泡時(shí)間顯著性不明顯，故選擇溶劑用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)作為Box-Behnken效應(yīng)面法中的考察因素。

2. 5 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝[7～8]

2. 5. 1 設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果 因?yàn)樘崛〈螖?shù)不是連續(xù)變量，故在本試驗(yàn)中，提取時(shí)間設(shè)為總提取時(shí)間、溶劑用量則為溶劑總用量，結(jié)合Plackett-Burnman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出的因素，選取提取次數(shù)、提取總時(shí)間和溶劑總用量3個(gè)因素為考察因素，分別以A、B、C表示，每個(gè)自變量的低中高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，自變量及水平見(jiàn)表5。以黃芪甲苷提取量、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和干膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用軟件Design-Expert8. 0. 5中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳提取工藝參數(shù)。方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 自變量及水平

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2. 5. 2 數(shù)據(jù)處理及模型的擬合 多指標(biāo)數(shù)據(jù)處理常采用總評(píng)“歸一值”（OD）法，對(duì)取值越小越好的指標(biāo)di=(ymax-yi)/(ymax-ymin)，對(duì)取值越大越好的指標(biāo)di=(yiymin)/(ymax-ymin)，OD=（d1d2d3……dn）1/n，i=1，2，3…，n，n為指標(biāo)數(shù)。運(yùn)用Design-Expert8.0.5.軟件，以O(shè)D值為響應(yīng)值對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，對(duì)OD值進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析

A2 1 0.042 0.042 4.11 0.0824 B2 1 0.089 0.089 8.76 0.0211 C2 1 9.563E-003 9.563E-003 0.94 0.3643殘差 7 0.071 0.010失擬檢驗(yàn) 3 0.051 0.017 3.29 0.1402純誤差 4 0.021 5.132E-003總誤差 16 1.42

利用Design-Expert8. 0. 5軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得OD值對(duì)提取次數(shù)(A)、提取總時(shí)間(B)及溶劑總用量(C)的二次多項(xiàng)回歸模型：OD=0.60+0.10A+0. 090B+0. 36C－0. 041AB－0.048AC－0.002375BC－0.100A2－0. 15B2+0.048C2，（r= 0.9500），模型具有顯著性（P=0.0009＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1402＞0.05），表明模型擬合度較高，回歸方程誤差較小。

2.5.3 效應(yīng)面分析及Box-Behnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù) 根據(jù)回歸方程分析結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert8. 0. 5軟件，固定3個(gè)自變量中的任意一個(gè)繪制其他2個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值（OD值）影響的等高線圖和三維曲面。見(jiàn)圖1-3。

圖1 提取次數(shù)和提取總時(shí)間對(duì)OD值影響的等高線和響應(yīng)面圖（左等高線，右響應(yīng)面）

圖2 提取次數(shù)和溶劑總倍數(shù)對(duì)OD值影響的等高線和響應(yīng)面圖（左等高線，右響應(yīng)面）

圖4 提取總時(shí)間和溶劑總倍數(shù)對(duì)OD值影響的等高線和響應(yīng)面圖（左等高線，右響應(yīng)面）

2.5.4 南寶戒毒清膠囊提取工藝參數(shù)的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證利用Design-Expert8. 0. 5軟件根據(jù)擬合的效應(yīng)面及等高線圖，結(jié)合二次回歸模型，預(yù)測(cè)南寶戒毒膠囊的最佳提取工藝參數(shù)為提前次數(shù)為2.22次，提取時(shí)間為3.77小時(shí)，溶劑總倍數(shù)為22.00倍，OD值為1.02483。考慮到大生產(chǎn)的可操作性，將工藝優(yōu)化為：加水提取2次，第一次加水12倍，提取2小時(shí)；第二次加水10倍，提取1.5小時(shí)。

稱取南寶戒毒清膠囊1000粒的處方量藥材，按優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取，并進(jìn)行浸膏得率和黃芪甲苷、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷提取量的測(cè)定，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明測(cè)定的OD值與理論OD值相近，RSD%為0.73%，表明模型的預(yù)測(cè)性較好且該提取工藝重復(fù)性較好。

3 討論

中藥及其復(fù)方中提取工藝的優(yōu)劣直接關(guān)系到臨床療效。常見(jiàn)的提取工藝優(yōu)化包括單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)等，這些方法往往存在試驗(yàn)組數(shù)量少，精密度不佳等問(wèn)題，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性不高、可靠性低，已不太實(shí)用。因此尋找更好、更可靠、更有效的試驗(yàn)研究方法成為當(dāng)下的關(guān)鍵。Plackett-Burnman是一種主要針對(duì)因子數(shù)較多，且未確定眾因子相對(duì)于響應(yīng)變量的顯著性而采用的篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過(guò)比較各因子兩水平的差異與整體的差異來(lái)確定因子的顯著性，從而達(dá)到篩選的目的，避免后期優(yōu)化試驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源[9]。Box-Behnken效應(yīng)面法是一種因素與響應(yīng)值之間顯非線性關(guān)系的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，不使用點(diǎn)而采用多元線性和二次項(xiàng)模型擬合，從而保證所有的因素落在一個(gè)均勻地水平，能較好地體現(xiàn)依賴變量與非依賴變量之間的關(guān)系，利用軟件的擬合可以對(duì)回歸方程的分析尋求最佳工藝參數(shù)[10]。本文通過(guò)Plackett-Burnman設(shè)計(jì)結(jié)合Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選出了南寶戒毒清膠囊的最佳提取工藝，經(jīng)驗(yàn)證與預(yù)測(cè)值接近，證明所選的提取方法合理、可行。