張紅玲，覃藝，孫佳彬，范潤(rùn)勇，黃勤挽 ，孫繼林，姚仁川

六神曲又名六曲、神曲，最早收載于《藥性論》：“化水谷宿食、結(jié)積滯，健脾暖胃”。六神曲以面粉麥麩為發(fā)酵基質(zhì)，加入苦杏仁、赤小豆，以青蒿、辣廖、蒼耳草煎煮的汁液混勻后發(fā)酵而成。主治功效為健脾和胃，消食調(diào)中。用于脾胃虛弱，飲食停滯，胸痞腹脹，小兒食積，臨床應(yīng)用廣泛。作為一種傳統(tǒng)的復(fù)方曲劑，其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制并不十分明確，目前藥典尚未收載該品種。雖然有一些地方標(biāo)準(zhǔn)收載六神曲，但是各地發(fā)酵工藝、炮制工藝存在較大差異，且并沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]。目前關(guān)于六神曲發(fā)酵工藝研究較多，而且工藝的統(tǒng)一初具模型，然而在發(fā)酵前原藥材的處理上尚沒有明確的規(guī)定，也沒有相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)，進(jìn)行了一系列的探索，以期為六神曲的發(fā)酵工藝控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藥材：苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣廖、蒼耳草，上述飲片均由四川輔正藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。

試劑試藥：蘆丁對(duì)照品（批號(hào)151023）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)150302）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)140601），均由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇等有機(jī)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FW135 型中草藥粉碎機(jī)( 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)、UV-6100型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）、ZDHW型電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、FA1204C型萬分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海將任實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、HHS-8S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）、RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁赤小豆粉碎工藝研究

按照六神曲標(biāo)準(zhǔn)，需將苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉。《中國(guó)藥典》對(duì)于粗粉的定義為：全部通過二號(hào)篩但混有通過四號(hào)篩不超過40%的粉末，故粉碎中過粗或者過細(xì)均不適合。

2.1.1 實(shí)驗(yàn)方法 采用單因素試驗(yàn)法，對(duì)苦杏仁、赤小豆采用單獨(dú)粉碎和混合粉碎的方法進(jìn)行考察，以粉碎成恰當(dāng)合格率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)如下：

（1）取苦杏仁、赤小豆各100g，置杯式粉碎機(jī)中，分別粉碎1min、2min、3min……直至粉末合格率達(dá)標(biāo)。

（2）取苦杏仁、赤小豆各50g，混合，置杯式粉碎機(jī)中，粉碎1min、2min、3min……直至粉末合格率達(dá)標(biāo)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見表1。

表1 苦杏仁、赤小豆粉碎工藝研究

從表1可見，單獨(dú)粉碎時(shí)，苦杏仁較難粉碎過篩，所需時(shí)間長(zhǎng)且回收率較低；而赤小豆較易粉碎，但是容易細(xì)粉過多，不符合粗粉要求?；旌戏鬯闀r(shí)，不至于過快粉碎導(dǎo)致細(xì)粉過多，較好控制粉碎程度，且粉末收得率高。在高速杯式粉碎機(jī)中，每100g樣品（苦杏仁、赤小豆各50g混合均勻），粉碎1min即可。工業(yè)大生產(chǎn)中，一般采用萬能粉碎機(jī)，將苦杏仁、赤小豆適量，等分混合均勻，采用2號(hào)篩網(wǎng)，粉碎通過即可。

2.2 辣蓼、青蒿、蒼耳草煎煮工藝研究

2.2.1 煎煮工藝設(shè)計(jì) 正交試驗(yàn)以出膏率及成分提取率為指標(biāo)，影響因素有加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)等，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)。按照六神曲標(biāo)準(zhǔn)的要求，制法中已經(jīng)規(guī)定了煎煮時(shí)間為1小時(shí)，煎煮次數(shù)為1次，故不再作為篩選考察指標(biāo)。取青蒿、辣廖、蒼耳草各約33.3g(合計(jì)100g），混合均勻，因素水平表見2。

2.2.2 含量測(cè)定 （1）對(duì)照品溶液的制備精密稱取槲皮素（綠原酸1mg）對(duì)照品10mg，用95%乙醇溶解并定容到10mL，超聲充分溶解即得1mg/mL的槲皮素(綠原酸)對(duì)照品溶液，備用。

（2）供試品溶液的制備取0.5mL原煎煮藥液，加無水乙醇定容到10mL，搖勻后超聲10min，過濾，取濾液作為供試品溶液備用。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定分別吸取對(duì)照品溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5mL于6個(gè)25mL容量瓶中，用95%乙醇定容到25mL；以加入0mL對(duì)照品的溶液作為空白溶液，在370nm處測(cè)定吸光度，并以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

（4）含量測(cè)定以加入0mL對(duì)照品的溶液作為空白溶液，直接將供試品溶液在370nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算各供試品槲皮素、綠原酸含量。

原藥液中槲皮素含量=所測(cè)得槲皮素含量*1000mL/0.5mL

原藥液中綠原酸含量=所測(cè)得綠原酸含量*1000mL/0.5mL

2.2.3 干膏率測(cè)定 精密量取25mL上述煎煮藥液，置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴加熱揮干，于105℃烘箱干燥至恒重,稱定重量，計(jì)算出膏率，每組平行2份，計(jì)算平均值。

干膏率=(干膏重*1000mL/25mL)/原藥材重100g*100%

2.2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 以槲皮素、綠原酸的含量以及干膏率進(jìn)行綜合評(píng)分為指標(biāo)。權(quán)重系數(shù)分配為：出膏率（權(quán)重20%）、槲皮素含量（權(quán)重40%）、綠原酸含量（權(quán)重40%）。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

2.2.5 試驗(yàn)結(jié)果 從表3可知，以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)時(shí)，A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C和D為定值。從表4可知，4個(gè)因素中，因素B（浸泡時(shí)間）對(duì)煎煮整體評(píng)分有顯著影響。因此辣蓼、青蒿、蒼耳草的最佳煎汁工藝組成為A3B2，而C、D因素為定值，即加入12倍水量，浸泡30min，加熱至沸騰后煎煮1h，煎煮一次。

表2 L9(34)因素水平表

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.3 濃縮工藝研究

2.3.1實(shí)驗(yàn)方法 按部頒六神曲標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取六神曲發(fā)酵其他固體成分處方量，逐漸加入提取藥液，每次加入100mL，直至制成符合“揉之成團(tuán)，觸之即散”標(biāo)準(zhǔn)的軟材。確定符合條件所需藥液的范圍。

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果 濃縮終點(diǎn)的判斷見表5。

從表10可見，在藥液500～800mL范圍內(nèi)，制備的軟材情況較好。故標(biāo)準(zhǔn)處方量下制備軟材所需液體量范圍為500～800mL。按12倍加水量記（不考慮藥材吸附和煎煮損失），藥液需濃縮33.3%～58.3%。

3 結(jié)論與討論

六神曲作為傳統(tǒng)發(fā)酵類中藥，發(fā)酵時(shí)各種條件變化都會(huì)影響其成品質(zhì)量。然而目前六神曲并沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不同地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)中，其生產(chǎn)工藝也存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)六神曲制備，對(duì)其發(fā)酵前期工作進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)量化統(tǒng)一，以期規(guī)范六神曲生產(chǎn)工藝。提高市場(chǎng)上六神曲產(chǎn)品質(zhì)量，保證其藥效。

《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十九冊(cè)》六神曲標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：原料藥七味，苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉，與面粉、麥麩混勻，另取辣蓼、青蒿、蒼耳草加水煎煮1小時(shí)，濾過，濾液濃縮成清膏，趁熱與上述藥粉拌勻。

現(xiàn)優(yōu)化工藝為以上七味，苦杏仁、赤小豆混合，過2號(hào)篩粉碎成粗粉，與面粉、麥麩混勻，另取辣蓼、青蒿、蒼耳草加12倍量水，浸泡30分鐘，煎煮1小時(shí)，用200目濾布板框?yàn)V過，濾液濃縮成清膏（原生藥6.5倍量水），趁熱與上述藥粉拌勻。