雷 佳，劉世巍，鄧秀敏

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院腎內(nèi)科(北京 100102)

主題詞 泌尿道感染 生物學(xué)鑒定法 質(zhì)譜法 藥物耐受性 聚合酶鏈反應(yīng)

尿路感染是最常見(jiàn)的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染之一，超過(guò)50%的女性一生中至少經(jīng)歷過(guò)1次尿路感染[1]，而曾患UTI的女性患者中高達(dá)25%會(huì)在隨后的日常生活中出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2]。在美國(guó)，尿路感染每年造成的花費(fèi)高達(dá)35億美元[3]，占相當(dāng)大額度的醫(yī)療保健支出，加之其高發(fā)病率及復(fù)發(fā)率，為公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。

目前，診斷和治療尿路感染的主要手段仍依賴(lài)于尿培養(yǎng)的結(jié)果，但此方法從鑒定病原體到藥敏試驗(yàn)(Antimicrobial susceptibility test，AST)總共至少需要42～78h[4]。臨床工作者，往往平均3d才能獲得致病菌及其藥敏結(jié)果。因此，經(jīng)驗(yàn)性的使用廣譜抗生素使得病原菌耐藥甚至多耐藥日趨嚴(yán)重。耐藥和耐多藥的病原體的出現(xiàn)更是造成全球范圍內(nèi)的醫(yī)療保健威脅[5]，因此，快速鑒定病原體及其抗菌藥物敏感性的技術(shù)成為尿路感染患者精確診斷、優(yōu)化治療以及改善抗生素濫用的迫切需求。近年來(lái)，即時(shí)檢驗(yàn)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等新型檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用將為尿路感染的診治帶來(lái)福音。現(xiàn)將上述檢測(cè)手段綜述如下。

1 菌尿即時(shí)篩選技術(shù)

即時(shí)檢驗(yàn)(Point of care testing，POCT)是當(dāng)今臨床檢驗(yàn)發(fā)展的趨勢(shì)之一。POCT不單純以提高檢測(cè)精度為目標(biāo)，而且對(duì)于推動(dòng)個(gè)體化化醫(yī)療和疾病篩查等具有重要意義[6]。對(duì)于尿液標(biāo)本的快速篩選不僅可以簡(jiǎn)化微生物室的試驗(yàn)流程，也可以減低成本，從而達(dá)到提高檢驗(yàn)效率的目的。

1.1 側(cè)流免疫層析 側(cè)流免疫層析(Lateral flow chromatographic assay ，LFCA))是一種將免疫標(biāo)記技術(shù)與色譜層析技術(shù)等相結(jié)合的固相膜免疫分析技術(shù)，該技術(shù)需通過(guò)標(biāo)記物獲取信號(hào)數(shù)據(jù)以分析結(jié)果，具有成本低廉、 操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果敏感性高和快速等優(yōu)點(diǎn)[7]。近年來(lái)，高靈敏度的光信號(hào)、磁信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)探針的應(yīng)用使得LFCA的靈敏度和精準(zhǔn)度取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，尤其是納米粒子應(yīng)用和發(fā)展，其被看作是LFCA的示蹤劑[8]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道早在2015年，新型的橫向流動(dòng)分析(RapidBac)技術(shù)已應(yīng)用于獸醫(yī)行業(yè)，目前正在人體研究中進(jìn)行評(píng)估，未來(lái)將應(yīng)用于快速的菌尿檢測(cè)[9]。RapidBac技術(shù)[9]對(duì)966份人體尿液標(biāo)本進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)尿液標(biāo)本細(xì)菌量≥103cfu/ml的靈敏度為86%，特異性為94%；革藍(lán)氏陰性菌細(xì)菌量≥104cfu/ml達(dá)到96%。這些數(shù)據(jù)對(duì)于LFCA未來(lái)在人體尿液檢測(cè)帶來(lái)了希望，下一步仍需通過(guò)多中心前瞻性研究鑒定此方法的精準(zhǔn)度。

1.2 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)是利用基于光束對(duì)細(xì)胞或微粒進(jìn)行參數(shù)定量分析和篩選的快速檢測(cè)技術(shù)，具有快速、靈敏、精確等突出優(yōu)點(diǎn)。在國(guó)外，F(xiàn)CM已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌常規(guī)檢查[10]，而我國(guó)起步較晚。常規(guī)細(xì)菌計(jì)數(shù)方法主要是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的平板法[11]和通用的顯微技術(shù)，F(xiàn)CM可以同時(shí)克服傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)和誤差大的缺點(diǎn)，快速得到細(xì)菌總數(shù)，若檢測(cè)的是一定體積樣品中的菌數(shù)，即得知菌濃度[12]。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)初步篩選尿液樣本可以減少進(jìn)一步分析的樣本數(shù)量來(lái)改進(jìn)臨床實(shí)驗(yàn)室工作流程，然而，流式細(xì)胞術(shù)僅僅是篩查菌尿，它不能夠提供病原體鑒定和藥敏試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行確定性診斷[13-15]。正在進(jìn)一步嘗試將一些形態(tài)信息納入光散射技術(shù)中[16]，例如用十二烷基硫酸鈉區(qū)分革藍(lán)氏陽(yáng)性菌和革藍(lán)氏陰性菌的差異以及區(qū)分不同桿菌的光散射圖案[17]，但是這些技術(shù)是仍是實(shí)驗(yàn)性的，有待于進(jìn)一步研究應(yīng)用于尿液檢測(cè)。

2 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)已使病原微生物的檢測(cè)達(dá)到了DNA、RNA水平，其在很大程度上可以提高檢驗(yàn)范圍與精度。已有研究證實(shí)許多病原微生物對(duì)特定抗菌藥物耐藥性具有一定遺傳基礎(chǔ)[18]，這一理論可以通過(guò)靶向病原體特異性分子標(biāo)記來(lái)識(shí)別病原體。MALDI-TOF質(zhì)譜、熒光原位雜交和聚合酶鏈反應(yīng)、基因芯片技術(shù)早已應(yīng)用于一些病原微生物感染的診斷。由于人類(lèi)尿液標(biāo)本pH值、電解質(zhì)濃度、細(xì)胞組成等差異的存在，導(dǎo)致利用上述技術(shù)檢測(cè)尿液標(biāo)本之前需要分離細(xì)菌細(xì)胞[19-20]。目前上述方法已在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行研究，未來(lái)利用該方法直接檢測(cè)尿液，從而達(dá)到診斷尿路感染的目的將成為可能，并且該法時(shí)效性和精準(zhǔn)性或優(yōu)于現(xiàn)有尿培養(yǎng)方法[20]。

2.1 多重聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(Plolymerase chainreaction，PCR)作為體外核酸擴(kuò)增技術(shù)其靈敏度和特異性使得能夠檢測(cè)到罕見(jiàn)的靶標(biāo)。國(guó)外有研究提出多重PCR通過(guò)同時(shí)加入多對(duì)引物，擴(kuò)增不同細(xì)菌特異性片段來(lái)同時(shí)快速檢測(cè)各種細(xì)菌，可直接對(duì)液體血培養(yǎng)物進(jìn)行提取檢測(cè)，更適合一般臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原菌的鑒定及初篩[21]。部分公司正在研究Septi Fast(實(shí)時(shí)PCR)技術(shù)用于直接檢測(cè)尿路感染患者尿液標(biāo)本[22]。為了探索該平臺(tái)對(duì)UTI診斷的可能性，利用Septi Fast直接檢測(cè)了疑似尿路感染患者的82份尿液標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性分別為82%和60%[22]。由于臨床中患者對(duì)尿液標(biāo)本的收集方式使得尿液標(biāo)本存在污染的可能性，造成PCR結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性可能，因此在利用PCR檢測(cè)尿液標(biāo)本之前要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行量化。實(shí)時(shí)定量PCR法可準(zhǔn)確定量標(biāo)本中特殊核酸的拷貝數(shù)的特點(diǎn)來(lái)測(cè)量細(xì)菌生長(zhǎng)量的方法，以此來(lái)判斷藥敏結(jié)果，這給臨床微生物藥敏試驗(yàn)提供了新的思路。

2.2 熒光原位雜交 熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH )是一項(xiàng)利用探針直接在染色體、細(xì)胞或組織水平定位靶序列的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，能夠?qū)?fù)雜的難培養(yǎng)和未培養(yǎng)的微生物進(jìn)行菌種鑒定、數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)等進(jìn)行分析。hemoFISH和QuickFISH已被FDA批準(zhǔn)用于鑒定血液中的病原微生物，hemoFISH使用DNA探針，而QuickFISH分析是基于肽核酸(PNA)探針，Quickfish可在20min內(nèi)檢測(cè)標(biāo)本，靈敏度和特異性>96%[23-25]。Quickfish可直接快速檢測(cè)尿路感染患者尿液中高濃度的細(xì)菌，但現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明FISH是受限于無(wú)法納入藥敏分析[26]，因此，未來(lái)用于尿路感染的診斷仍存在挑戰(zhàn)。

2.3 MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù) MALDI-TOF MS以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)分子已應(yīng)用于大腸埃希氏菌的檢測(cè)[27]。Ferreira等[28]選取尿液中細(xì)菌大于105cfu/ml標(biāo)本進(jìn)行研究，結(jié)果顯示尿標(biāo)本經(jīng)過(guò)差速離心法處理后，可將91.8%的菌株鑒定到種。Lotz等[29]的研究顯示，對(duì)菌株進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)本前處理之后，MALDI-TOF MS對(duì)于分枝桿菌鑒定的準(zhǔn)確率可達(dá)97%；其中67%可鑒定到種的水平，30%可鑒定到復(fù)合體的水平。由于大腸埃希菌和志賀菌的蛋白質(zhì)譜圖很相似，兩者無(wú)法通過(guò)MALDI-TOF MS區(qū)分；其次，儀器的初始購(gòu)買(mǎi)價(jià)格很高，標(biāo)本前處理過(guò)于復(fù)雜，雖然MALDI-TOF MS已大型臨床實(shí)驗(yàn)室中使用，但利用質(zhì)譜診斷早期尿路感染的價(jià)值并不高[29]。

2.4 微流控芯片 “微流控芯片”這一概念是由Whitesides[30]研究團(tuán)隊(duì)首次提出的。近年來(lái)，其逐漸發(fā)展成熟，憑借分析快速、成本低、消耗低、重現(xiàn)性好、通量高、多功能、集成好并可以在接近生理環(huán)境下運(yùn)行等特點(diǎn)，成為近年來(lái)熱點(diǎn)前沿分析技術(shù)之一[31]。文小霞等[32]人選用4種尿路感染常見(jiàn)病原菌作為模擬測(cè)試對(duì)象，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)這種芯片方法在15h內(nèi)可完成細(xì)菌鑒定，檢測(cè)限可達(dá)101cfu/ml。齊明月等[33]人以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌為模擬測(cè)試對(duì)象進(jìn)行分析，結(jié)果表明，芯片方法可以在18h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)3種細(xì)菌的同時(shí)鑒定及6種抗生素敏感性測(cè)試，與傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法和抗生素敏感性測(cè)試結(jié)果一致性分別為94.1%和93.9%。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，利用納米熒光標(biāo)記探針可有效克服芯片檢測(cè)中面臨的低靈敏度和低選擇性的兩重限制，實(shí)現(xiàn)病原微生物多位點(diǎn)和多對(duì)象的鑒定。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，尿路感染的高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率及其造成的龐大醫(yī)療支出等因素促使尿路致病菌的快速、實(shí)時(shí)、精準(zhǔn)檢驗(yàn)成為目前臨床診治的關(guān)鍵；其次，改善和遏制病原微生物耐藥和多耐藥情況也依賴(lài)于即時(shí)檢驗(yàn)手段的發(fā)展。菌尿即時(shí)篩選技術(shù)，如側(cè)流免疫層析、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用減少了微生物實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)流程，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，更重要的是縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，使尿路感染檢測(cè)“實(shí)時(shí)”化發(fā)展；分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得檢驗(yàn)水平的特異性、靈敏性和自動(dòng)化有所提高，其與納米技術(shù)的結(jié)合更使檢驗(yàn)范圍擴(kuò)展化，使尿路感染的檢測(cè)趨向于“精準(zhǔn)”化。然而由于各地醫(yī)療環(huán)境的限制，我國(guó)目前仍以傳統(tǒng)的檢測(cè)手段為主，上述新興技術(shù)仍局限于實(shí)驗(yàn)室水平；其次，由于檢驗(yàn)設(shè)備費(fèi)用昂貴，部分技術(shù)標(biāo)本檢測(cè)前的處理步驟復(fù)雜，二級(jí)、一級(jí)甚至社區(qū)醫(yī)院想要實(shí)現(xiàn)新興技術(shù)的應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)。未來(lái)一旦，這些問(wèn)題能夠解決，開(kāi)發(fā)和應(yīng)用上述快速，精準(zhǔn)的尿路感染檢測(cè)手段將有助于臨床診斷和治療。早期精準(zhǔn)的治療過(guò)程不僅有利于患者的預(yù)后，而且有利于改善臨床中抗生素濫用和管理。尿路感染的精準(zhǔn)治療依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室診斷，而精準(zhǔn)的診斷離不開(kāi)上述檢測(cè)手段的發(fā)展，在及時(shí)的時(shí)間應(yīng)用正確的藥物是尿路感染患者治療的關(guān)鍵。