喬建軍

芪術(shù)兩活湯（QZLHD）系清代陳士鐸《辨證錄》卷三遍身骨痛門(mén)首載，主要用于治療痛風(fēng)之證，“然痛風(fēng)之癥，多感于風(fēng)濕，而風(fēng)濕之感，多入于骨髓”，“以骨髓屬腎，腎可補(bǔ)而不可瀉”，“瀉胃與大腸之風(fēng)濕，而腎之風(fēng)濕自去”。該方對(duì)痛風(fēng)的治療辨證明確，但其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論依據(jù)尚未得以確定。關(guān)節(jié)的紅腫、熱痛是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎最常見(jiàn)臨床表現(xiàn)，故抗炎鎮(zhèn)痛作用是評(píng)價(jià)藥物治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效的重要指標(biāo)。前期實(shí)驗(yàn)表明QZLHD水提液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠具有抗炎作用，本實(shí)驗(yàn)觀察QZLHD水提液乙酸乙酯部位及乙醇部位在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型上的藥效，以探討QZLHD對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療效果及有效成分群，以期為臨床應(yīng)用此方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Sprague－Dawley大鼠，8～10 周齡，體質(zhì)量（290±10）g（購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014－0004，置于本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)房?jī)?nèi)飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。室溫（20±2）℃，濕度50%±5%。每日清潔一次底墊，期間自由進(jìn)食普通鼠飼料，飲用自來(lái)水。

1.2 藥品與試劑 人參（批號(hào)：201512），肉桂（批號(hào)：201508），白術(shù)（批號(hào)：201512），黃芪（批號(hào)：201506），茯苓（批號(hào)：201501），甘草（批號(hào)：201512），羌活（批號(hào)：201508），獨(dú)活（批號(hào)：201511）均購(gòu)于國(guó)藥樂(lè)仁堂醫(yī)藥有限公司張家口市分公司，阿司匹林片（批號(hào)：20151222，重慶迪康長(zhǎng)江制藥有限公司），尿酸鈉（美國(guó) sigma公司，批號(hào)：U2875－5G）；白介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司）；尿酸試劑盒（北京柏定生物工程有限公司，批號(hào)：000020161）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶生物有限公司，批號(hào)：20150622）。

1.3 儀器 1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），萬(wàn)分之一Sartorius精密電子天平（德國(guó)賽多利斯天平公司），TL4型偏振光高倍顯微鏡（日本OLYMPUS公司），KDC－2044型低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司），BL－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1 QZLHD的提取及供試液的制備 將藥材于60℃干燥2 h后，按照QZLHD處方的比例（人參∶肉桂∶白術(shù)∶黃芪∶茯苓∶甘草∶羌活∶獨(dú)活=9∶9∶30∶30∶15∶3∶1.5∶1.5），稱(chēng)取 QZLHD 藥材 20 kg，加 5 倍量的蒸餾水回流提取40 min，過(guò)濾后，濾渣加3倍量的蒸餾水，繼續(xù)回流提取30 min，過(guò)濾后，合并兩次濾液，濃縮為膏狀，質(zhì)量為3.2 kg。依次用乙酸乙酯、75%乙醇提取，每次1 000 mL，各提取3次，濃縮后，得乙酸乙酯部位50 g、乙醇部位500 g。分別加水適量制成混懸液，溶解時(shí)加入適量Tween 80助溶，制備各藥用部位濃度分別為：2.5和25 mg/mL的供試液，濃度均約相當(dāng)于1 g藥材/mL[1]。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 取清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為9組，每組10只，即正常組、模型組、阿司匹林組（270 mg/kg）、QZLHD水提液乙酸乙酯部位低、中、高劑量組 （15、25、50 mg/kg）及QZLHD水提液乙醇部位低、中、高劑量組（150、250、500 mg/kg）。造模5 h后灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，模型組和正常組給予等體積生理鹽水。

2.3 大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的制備 參照文獻(xiàn)[3]方法制備大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉10 mL/kg麻醉，左側(cè)后足踝關(guān)節(jié)背側(cè)常規(guī)消毒后，將注射針與脛骨成45°方向刺入踝關(guān)節(jié)腔，注入均勻混合的濃度為30 g/L尿酸鈉混懸液0.1 mL，正常組踝關(guān)節(jié)腔中注射0.1 mL生理鹽水。

2.4 指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定 于造模后5h、24h、3d、5d、7 d，采用縛線法測(cè)定大鼠右后踝關(guān)節(jié)同一部位的周徑，按以下公式計(jì)算腫脹度[3]。

腫脹度=（致炎后踝關(guān)節(jié)周徑-致炎前踝關(guān)節(jié)周徑）/致炎前踝關(guān)節(jié)周徑

2.4.2 大鼠血清中尿酸（UA）的含量測(cè)定 末次給藥3 h后將大鼠用0.3%戊巴比妥鈉10 mL/kg腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫放置2 h，3 500 r/min離心10 min，留取血清，按尿酸試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中尿酸含量。

2.4.3 大鼠血清IL-1β、TNF-α含量的檢測(cè) 取2.4.2項(xiàng)下制備的血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)并計(jì)算 IL-1β、TNF-α 濃度[4-5]。

2.4.4 大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)觀察及單位面積炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 大鼠取血后，取關(guān)節(jié)組織，10%甲醛固定30 h，8%硝酸溶液中脫鈣48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，常規(guī)切片，厚度3 μm，HE染色。于400倍光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟組織病理形態(tài)學(xué)改變[6-7]；選取炎癥細(xì)胞最密集區(qū)域，觀察關(guān)節(jié)軟組織及關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集情況，計(jì)數(shù)單個(gè)鏡下視野內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較若方差齊采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定 與正常組大鼠比較，造模后5 h、24 h、3 d、5 d、7 d 模型組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹均顯著增加（P＜0.01），24 h腫脹最為明顯，出現(xiàn)明顯的造模關(guān)節(jié)局部皮膚發(fā)紅、皮溫升高、運(yùn)動(dòng)障礙等致炎癥狀，關(guān)節(jié)腫脹度在達(dá)高峰后下降。與模型組比較，各治療組在5 h時(shí)，關(guān)節(jié)腫脹均無(wú)顯著差異。24 h后，阿司匹林組各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)腫脹均顯著減輕（P＜0.01）；QZLHD水提液乙醇部位組均能顯著降低腫脹度（P＜0.01），且具有劑量依賴(lài)性；其余各組與模型組比較差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3.2 大鼠血清中UA的含量測(cè)定 與正常組比較，模型組UA水平顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，阿司匹林組和QZLHD水提液乙醇部位低、中、高劑量組能顯著降低血清中UA水平（P＜0.01），乙酸乙酯部位組與模型組比較差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

3.3 大鼠血清IL-1β、TNF-α表達(dá)的檢測(cè) 模型組大鼠血清IL-1β及TNF-α濃度均顯著高于正常組（P＜0.05）；乙醇低、中、高劑量組及阿司匹林組大鼠血清IL-1β及TNF-α濃度顯著低于模型組（P＜0.05），乙酸乙酯部位組與模型組比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表 2。

3.4 大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)改變及單位面積炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 正常組大鼠的踝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組滑膜組織內(nèi)見(jiàn)有尿酸鹽結(jié)晶體，炎癥明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞排列不整齊，纖維炎性蛋白滲出物。與模型組比較，阿司匹林組滑膜組織有輕度炎性滲出，滑膜細(xì)胞增生，但細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)較完整。QZLHD水提液乙醇部位低劑量組滑膜組織有水腫，表面有炎性滲出，細(xì)胞邊緣不規(guī)整；中劑量組滑膜組織炎性滲出明顯減輕，有水腫，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞邊緣整齊，形態(tài)較規(guī)則；高劑量組滑膜組織有水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但滲出減輕；QZLHD水提液乙酸乙酯部位高、中、低劑量組滑膜組織內(nèi)病理形態(tài)與模型組相似，可見(jiàn)有尿酸鹽結(jié)晶體，炎癥明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞排列不整齊，纖維炎性蛋白滲出物。見(jiàn)圖1。模型組及QZLHD水提液乙酸乙酯部位組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于正常組（P＜0.01），阿司匹林組和QZLHD水提液乙醇部位低、中、高劑量組均顯著低于模型組（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表 2。

4 討論

痛風(fēng)是長(zhǎng)期嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄減少引起的一組疾病。高尿酸血癥和尿酸鹽結(jié)晶沉淀是其重要臨床特征，同時(shí)，血尿酸的測(cè)定也是痛風(fēng)的臨床診斷項(xiàng)目之一[8]。本研究表明，QZLHD水提液乙醇低、中、高劑量組大鼠血尿酸水平顯著低于模型組，并且能顯著降低關(guān)節(jié)腫脹度，改變大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)，可有效控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀。

血清IL-1β是目前公認(rèn)的最重要的炎癥細(xì)胞因子之一，大量IL-1β聚集有確切的致炎作用[9]。在關(guān)節(jié)部，IL-1β可刺激TNF-α等細(xì)胞因子的分泌[10]，因此，TNF-α也與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，QZLHD水提液乙醇部位低、中、高劑量組及阿司匹林組大鼠血清IL-1β及TNF-α濃度顯著低于模型組，提示，QZLHD對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用與抑制IL-1β及TNF-α表達(dá)有關(guān)。

研究表明QZLHD水提液乙醇部位能顯著抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度，顯著降低模型大鼠血清中UA水平，并能改善滑膜組織病理狀態(tài)。而QZLHD水提液乙酸乙酯部位均未見(jiàn)改善作用，提示QZLHD治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的有效部位是乙醇提取物。說(shuō)明QZLHD治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是極性較高的成分，如：人參皂苷、肉桂酸、黃酮苷等共同作用的結(jié)果，乙酸乙酯部位中的主要成分為黃酮苷元、香豆素等，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)QZLHD乙酸乙酯部位具有治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。此結(jié)論提示對(duì)QZLHD的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用應(yīng)針對(duì)乙醇部位，即高極性化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，以確定其確切物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 QZLHD對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響（x±s）Tab.1 Effects of QZLHD on degree of joint swelling of rats with gouty arthritis（x±s）cm

表2 QZLHD對(duì)大鼠血清中UA、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及IL-1β、TNF-α水平的影響（x±s）Tab.2 Effects of QZLHD on the levels of UA,lymphocyte,IL-1β and TNF-α in serum of rats（x±s）

圖1 QZLHD對(duì)大鼠關(guān)節(jié)病理組織變化的影響(HE，×400)Fig.1 Effects of QZLHD on pathological morphology of the joint tissue of rats(HE，×400)

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