王建國 綜述，李 一，劉錦平△ 審校

(1.遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563003；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院乳腺外科，四川 成都 610072)

乳腺癌發(fā)病機制復雜，是一個多因素、多步驟的過程，涉及多種遺傳因素、代謝風險和生活方式，但具體分子機制尚不明確。研究表明，原癌基因被激活，抑癌基因失活是乳腺癌發(fā)生的一個重要過程。近年來，同源結(jié)構域相互作用蛋白激酶2(HIPK-2)與腫瘤的關系日益受到重視，HIPK-2被認為是一種腫瘤抑制基因，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用；同時，HIPK-2也被認為是一種腫瘤標記物，其表達水平對指導抗腫瘤治療有重要作用。

1 HIPK-2基本結(jié)構

HIPK-2是1998年由Kim研究組首先發(fā)現(xiàn)，屬于同源結(jié)構域相互作用蛋白激酶家族，此家族共有4名成員，分別為HIPK-1、HIPK-2、HIPK-3以及HIPK-4。HIPK-2基因定位于人類7號染色體長臂3區(qū)3帶到3區(qū)4帶之間(7q33～7q34)，包含13個外顯子，大小約59×103 bp[1]。HIPK2是一種定位于細胞核內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在各種生物體中比較保守。HIPK-2作為轉(zhuǎn)錄共抑制因子，包含多個功能域：一個家庭蛋白的相互作用域，一個共抑結(jié)構域，一個PEST序列，一個名叫YH域的COOH-末端和位于N端側(cè)的蛋白激酶催化結(jié)構域[1]。

2 HIPK-2的亞細胞定位及組織分布

HIPK-2定位于核斑點，它是共阻遏物的組成部分，是包含Groucho和組蛋白脫乙酰酶的復合物[2]。HIPK-2與這些蛋白的相互作用的是通過家庭蛋白相互作用域(HID)來完成的。Pierantoni等[3]研究發(fā)現(xiàn)，HIPK-2在成年小鼠組織中無處不在表達，只是在不同的組織表達有所不同。HIPK-2在肌肉、心、小腸、胃、腎和腦中表達豐富，而在皮膚和肺中觀察到表達水平非常低。HIPK-2普遍存在于人類成人組織中，在心臟、肌肉、腎臟中的表達比腦、白細胞、睪丸、前列腺、卵巢和小腸中表達高[4]。

3 HIPK-2在腫瘤中的作用機制研究

HIPK-2在抗癌治療中有重要作用，它可誘導腫瘤細胞凋亡，通過激活各種下游信號通路起作用，最突出的是通過抑癌基因 p53 起作用[4]。HIPK-2失活導致p53信號傳導途徑功能障礙，從而誘導化療耐藥，血管生成，腫瘤生長[5]。因此，HIPK-2是一個潛在的的生物標志物和腫瘤治療的靶標。了解HIPK-2抑癌和失活的分子機制，將會使其在腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)歸中的作用更加清晰。

3.1HIPK-2抑制腫瘤的分子機制研究

3.1.1HIPK-2調(diào)節(jié)p53依賴的分子促進細胞凋亡

HIPK-2可以被幾種類型的基因毒性損傷激活：如紫外線輻射(UV)，電離輻射(IR)和抗腫瘤藥物如順鉑(CDDP)、阿霉素(ADR)等[6]。HIPK-2作為促凋亡因子(如p53)的激活劑，激活p53抑癌基因的細胞凋亡活性，從而促進細胞凋亡。① HIPK-2使p53磷酸化：HIPK-2使p53絲氨酸46(Ser46)磷酸化并允許募集組蛋白乙酰化酶(HAT)p300在賴氨酸382(Lys382)處有效的p53乙?；痆7]。這些翻譯修飾后的p53能特異性誘導p53依賴性促凋亡基因轉(zhuǎn)錄(如p53AIP1，Noxa，Puma)，從而抑制血管生成、腫瘤生長[8]。②HIPK-2抑制Nox1活性：HIPK-2敲低有助于p53通過不同的方式失活，而不只是通過直接損害p53Ser46磷酸化。通過對siRNA沉默HIPK-2的結(jié)腸癌細胞cDNA基因芯片分析[9]，顯示了Nox1上調(diào)。Nox1是超氧化物酶NADPH的同源催化亞基，通常在腫瘤中過表達并參與腫瘤進展和血管生成。HIPK-2被證明有抑制Nox1啟動子活性的作用，若敲低HIPK-2，可誘導Nox1上調(diào)和Nox1過度表達，進而通過誘導p53Lys382去乙?；瘉頁p傷p53凋亡轉(zhuǎn)錄活性[10]。③HIPK-2降低使金屬硫蛋白2A(MT2A)表達上調(diào)：金屬硫蛋白是包含至少10個富含半胱氨酸蛋白質(zhì)亞型的家族，在保持基本金屬的穩(wěn)態(tài)中具有潛在的作用。金屬硫蛋白家族(MTs)的表達上調(diào)已在乳房、結(jié)腸、肝臟和肺腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，并在獲得性耐藥中扮演重要角色[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，HIPK-2減少可導致p53蛋白質(zhì)錯誤折疊；錯誤折疊后形成的p53異構體，損害了p53/DNA結(jié)合和p53轉(zhuǎn)錄活性[9]。這種p53錯誤折疊，在結(jié)腸癌和乳腺癌細胞中可能小部分歸因于金屬硫蛋白2A(MT2A)在HIPK-2減少后表達上調(diào)[12]。在HIPK-2敲低細胞中，可通過siRNA消除MT2A，可恢復野生型P53(wtp53)的天然構象和p53在藥物反應中的功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)細胞類型中，鋅通常以與MT結(jié)合的形式而存在，游離鋅濃度會相當?shù)?；在異種移植的結(jié)腸癌細胞模型中，給缺乏HIPK-2的細胞補充鋅劑能夠恢復野生型p53(wtp53)構象和p53凋亡轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制腫瘤生長[13]。④Zyxin穩(wěn)定HIPK-2：在HIPK-2/p53信號軸中，響應DNA損傷反應的調(diào)節(jié)因子是域蛋白Zyxin，它是一種肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)因子，通過抑制Siah-1介導的HIPK-2降解來穩(wěn)定HIPK-2[14]。因此，減少Zyxin，就會降低HIPK-2穩(wěn)定性和抑制DNA損傷誘導的p53Ser46磷酸化和細胞凋亡。⑤HIPK-2與Axin結(jié)合：另一種在DNA損傷反應中微調(diào)p53激活閾值的分子是Axin，它使p53與Pirh2、Tip60、HIPK-2形成不同的復合物[15]。在亞致死DNA損傷時，Pirh2與HIPK-2競爭后與Axin結(jié)合，誘導的p53Ser46磷酸化。在致命的DNA損傷提示時，Pirh2-Axin失效，形成一個Axin-Tip60-HIPK2-p53復合物，其導致p53凋亡激活[15]。

3.1.2HIPK-2調(diào)節(jié)p53非依賴性的分子促進細胞凋亡 HIPK-2促進細胞凋亡的作用還可與p53無關。HIPK-2作為抗凋亡因子抑制劑，可調(diào)節(jié)抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子(如抗凋亡轉(zhuǎn)錄共抑制因子CtBP，p53抑制劑MDM2和ΔNp63α)，促進細胞凋亡。HIPK-2參與的紫外線輻射觸發(fā)CtBP清除的途徑，導致細胞死亡。HIPK-2在Ser-422處磷酸化CtBP，從而誘導蛋白質(zhì)降解。敲低HIPK-2，能抑制UV誘導的CtBP-Ser-422磷酸化，并使其在缺失p53的H1299肺癌細胞中降解，這證實了HIPK-2在細胞中的凋亡作用缺乏p53[16]。MDM2是p53陰性的主要調(diào)節(jié)因子，它是致癌基因，通常在腫瘤中表達上調(diào)。MDM2可根據(jù)細胞的要求微調(diào)p53介導的生物學結(jié)果(如細胞周期停滯與細胞凋亡)。然而，盡管有wtp53的存在，在過度表達MDM2的腫瘤中，p53仍然失活。因此，使用小分子MDM2抑制劑，可抑制MDM2/p53相互作用，重新激活p53和誘導腫瘤細胞凋亡[17]。此方法可阻止HIPK-2降解，并重新激活p53凋亡功能。有趣的是，鋅離子治療已被證明可恢復MDM2誘導的HIPK-2下調(diào)，通過抵消MDM2 E3泛素連接酶活性，最終重新激活HIPK-2誘導的p53Ser46磷酸化和凋亡活動[18]，但其分子機制仍需要闡明。HIPK-2的減少能誘導癌細胞即使在p53缺失時也對不同的抗癌藥物耐藥，這暗示HIPK-2的參與的調(diào)節(jié)路徑，還有除p53以外的靶標，特別是ΔNp63α的發(fā)現(xiàn)[19]。它是p63的異構體，能被HIPK-2磷酸化并促進蛋白酶體降解。HIPK-2在T397殘基處磷酸化ΔNp63α，但是，沒有磷酸化的ΔNp63α-T397A突變體不降解，盡管有HIPK-2過度表達或ADR治療。這些發(fā)現(xiàn)表明，Np63α將成為HIPK-2對遺傳毒性藥物反應的新靶標。

3.1.3HIPK-2防止胞質(zhì)分裂中四倍體形成 最近，HIPK-2在胞質(zhì)分裂中的亞細胞定位和生物學功能被證實[20]。胞質(zhì)分裂中的子細胞在細胞分裂的最后一步通過收縮兩個重新形成的細胞核間的細胞質(zhì)間橋而分開，胞質(zhì)分裂失敗則可能產(chǎn)生四倍體細胞。四倍體細胞具有染色體不穩(wěn)定的特點，最終會導致非整倍體到致瘤性的轉(zhuǎn)化[21]。組蛋白H2B，在胞質(zhì)分裂過程中定位于中間體的細胞間橋內(nèi)。HIPK-2直接結(jié)合H2B并將其在絲氨酸殘基14(Ser14)處磷酸化。盡管HIPK-2和S14磷酸化的H2B(H2B-S14P)都有凋亡功能，且這兩種蛋白質(zhì)共定位在中間體，但其染色體在胞質(zhì)分裂過程中是獨立存在的，如DNA損傷和細胞凋亡。在胞質(zhì)分裂的最后一步，通過靶向基因破壞或siRNA干擾使H2BS14P在中間體中缺失，最終導致HIPK-2減少，將會誘導細胞因子依賴性畸變的積累，包括四倍體和多倍體化。值得注意的是，磷酸模擬物H2B-S14D突變體的表達可以拯救這些胞質(zhì)分裂缺陷，表明HIPK-2介導的H2BS14磷酸化是細胞分裂所必需的[20]。這項研究表明HIPK-2作為腫瘤抑制因子的作用也可能是通過阻止四倍體細胞的形成來實現(xiàn)的，這也對理解p53通過防止倍性形成來發(fā)揮抑癌作用的機制提供了重要啟示。另外，由于HIPK-2在p53促凋亡活性激活中起關鍵作用，如果HIPK-2失活，可能立刻產(chǎn)生四倍體細胞并抑制其功能。HIPK-2敲除大大降低了腫瘤細胞修復受損DNA的功能，至少部分損害了p53的功能，提示HIPK-2抑制可能增加基因組的不穩(wěn)定性，從而有利于腫瘤的進展[22]。

3.2HIPK-2失活機制研究

3.2.1細胞質(zhì)定位 最近的研究表明高遷移率組蛋白A1(HMGA1)與p53相互作用，抑制P53的凋亡活性。研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1過度表達使HIPK-2細胞質(zhì)異位，從而抑制HIPK-2/p53相互作用和凋亡激活[23]。HMGA1在腫瘤中常常過表達，并且與乳腺癌組織中野生型p53的低凋亡指數(shù)相關[23]。乳腺導管癌的免疫染色顯示：HIPK-2核定位時，HMGA1低表達和高凋亡指數(shù)；HIPK-2細胞質(zhì)定位時，HMGA1高表達和低凋亡指數(shù)；這意味著HIPK-2可能失活[24]。在HIPK-2細胞質(zhì)定位時，乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了整合素α(6)β(4)，其參與p53凋亡活性的損傷[24]。說明HIPK-2細胞質(zhì)再定位可能是p53功能受損的一個原因。

3.2.2雜合性丟失(LOH) HIPK-2參與了p53介導的對半乳糖凝集素-3(Gal-3)的抑制。Gal-3是一種β-半乳糖苷特異性凝集素，具有抗凋亡活性，參與腫瘤發(fā)生和化療藥耐藥[25]。但是，在分化良好的甲狀腺癌(WDTCs)中，Gal-3高表達，盡管存在的野生型p53應該負調(diào)控Gal-3。這種情況只能解釋為，在WDTC中，wtp53蛋白無活性。對冷凍甲狀腺組織標本中提取的總RNA進行實時PCR和免疫組化分析顯示，HIPK-2在WDTCs中的確下調(diào)[26]。在用Gal-3染色的甲狀腺癌細胞中，通過激光捕獲顯微切割(LCM)檢索，雜合性丟失(LOH)分析發(fā)現(xiàn)，HIPK-2 發(fā)生了遺傳丟失[26]。這項研究表明HIPK-2在WDTC中表達的喪失可能是缺乏p53無活性的原因，從而解釋了野生型p53存在時，Gal-3仍有過表達。另外，在小鼠中也觀察到HIPK-2的 LOH。一項對輻射誘導的胸腺淋巴瘤遺傳改變篩查發(fā)現(xiàn)，HIPK-2是一個體內(nèi)腫瘤抑制基因，30%的腫瘤中缺失一個HIPK-2等位基因，這增加HIPK-2 +/-小鼠對放射誘導的胸腺淋巴瘤的易感性[27]。這項研究提供了令人信服的證據(jù)表明HIPK-2是體內(nèi)響應電離輻射主要的腫瘤抑制劑，并且這個功能似乎是部分獨立于p53的。

3.2.3缺氧 在實體瘤中抑制HIPK-2功能的生理條件是缺氧，這是腫瘤進展和治療失敗的一個標志。缺氧激活了缺陷型同系物-2(Siah-2)中的RING家族連接酶7，其誘導HIPK-2蛋白酶體降解[28]。缺氧的存在使得腫瘤細胞選擇更惡性和侵入性的表現(xiàn)來對抗常規(guī)化療和放療，其在患者預后中起負面作用。降低缺氧利用率中的關鍵因子是缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)，其參與誘導血管生成，化療耐藥，葡萄糖代謝和侵襲。HIF-1由組成性表達亞基HIF-1β和HIF-1α組成，其穩(wěn)定性受低氧刺激或遺傳改變而改變[29]。HIPK-2已被證明能抑制HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄[29]，從而對抗缺氧和恢復腫瘤細胞對化療的敏感性，這與P53基因狀態(tài)無關。有研究顯示，HIF-1α過表達可誘導HIPK-2蛋白酶體降解，從而抑制p53Ser46磷酸化，最終拮抗p53介導的細胞凋亡[30]。這種新型的HIF-1α、HIPK-2和p53分子監(jiān)管路徑，給無功能野生型p53存在的腫瘤中，藥物在缺氧條件下抑制p53的細胞凋亡作用給出了合理解釋。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可能是鋅離子誘導HIF-1α蛋白酶體降解的靶標[31]，這將開辟重新激活缺氧抑制HIPK-2/p53途徑的新道路。這一發(fā)現(xiàn)在對缺氧處理的癌細胞中的cDNA基因芯片研究中得到了證實。研究表明鋅離子確實逆轉(zhuǎn)了缺氧誘導基因的轉(zhuǎn)錄[32]。鋅離子將成為與抗癌藥物組合來恢復HIPK-2/p53途徑的有價值的工具。

4 HIPK-2通過Wnt/β-catenin信號通路抑制腫瘤進展

Wnt/β-catenin 信號通路被稱為經(jīng)典信號通路，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在此信號通路中扮演著極其重要的角色，是整條通路的關鍵樞紐分子，其在胞質(zhì)中的濃度直接決定了 Wnt 信號通路的開放或關閉[9]。HIPK2 磷酸化β-catenin的Ser33和Ser37，降低β-catenin的穩(wěn)定性，降低細胞核中β-catenin的量，因而能抑制β-catenin介導的細胞增殖和腫瘤形成[33]，其分子機制已明確，研究表明，HIPK-2磷酸化β-catenin以進行蛋白酶體降解，干擾了幾個β-catenin靶基因的轉(zhuǎn)錄(如血管內(nèi)皮生長因子VEGF)，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長[34]。

5 HIPK-2在相關腫瘤中的研究

對結(jié)腸癌細胞的研究顯示[9]，Nox1表達上調(diào)。HIPK-2敲低，誘導Nox1上調(diào)和Nox1過度表達，進而通過誘導p53Lys382去乙?；瘉頁p傷p53凋亡轉(zhuǎn)錄活性[10]，從而促進腫瘤發(fā)生與進展。在乳房、結(jié)腸、肝臟和肺腫瘤中發(fā)現(xiàn)，HIPK-2減少后金屬硫蛋白家族(MTs)的表達上調(diào)[11]，這導致p53蛋白質(zhì)錯誤折疊，從而損害了p53/DNA結(jié)合和p53轉(zhuǎn)錄活性，導致腫瘤發(fā)生。在神經(jīng)母細胞瘤中，MYCN過表達。MYCN通過ATM依賴的DNA損傷反應(DDR)激活HIPK-2，再經(jīng)HIPK-2/p53Ser46通路，使神經(jīng)母細胞瘤細胞對細胞凋亡更敏感[35]，從而抑制腫瘤進展。一項關于皮膚癌的研究，調(diào)查了生殖器高危人乳頭狀瘤病毒(HPV)的致癌基因E6和HIPK-2之間的關系。研究發(fā)現(xiàn)，E6的β2PV類型(HPV23和HPV38)，皮膚γPV(HPV4)或生殖器HPV16，與HIPK-2相互物理作用，通過強制解離HIPK-2/p53復合物，抑制HIPK-2介導的p53Set46磷酸化[36]，從而可能有助于皮膚癌變，提示可能機制是抑制HIPK-2/p53功能。人類急性骨髓系白血病(AMLs)中發(fā)現(xiàn)HIPK-2核分布異常，這損害了p53細胞凋亡和轉(zhuǎn)錄活性[37]，也再次確認HIPK-2使p53激活而抑制腫瘤生長中的作用。在對順鉑耐藥卵巢癌細胞中，外源性HIPK-2過表達能夠避免細胞凋亡受抑制[38]，但其分子機制還不明確。HIPK-2在分化良好的甲狀腺癌(WDTCs)中，發(fā)生雜合性丟失，導致半乳糖凝集素3(Gal-3)過度表達[26]。這項研究還表明HIPK-2在WDTC中表達的喪失可能是缺乏p53激活的原因，從而解釋了存在野生型p53時，Gal-3仍有過表達。另外一篇報道稱HIPK-2的高表達可能與宮頸癌的發(fā)生有關，抑制HIPK-2的表達可以抑制宮頸癌細胞凋亡，從而促進細胞生長和細胞的運動能力[39]。

6 HIPK-2在乳腺癌中的研究

HIPK-2在乳腺癌細胞中導致p53蛋白質(zhì)錯誤折疊已如前述。另外，乳腺導管癌的免疫染色顯示：HIPK-2核定位時，高遷移率組蛋白A1(HMGA1)低表達和高凋亡指數(shù)；HIPK-2細胞質(zhì)定位時，HMGA1高表達和低凋亡指數(shù)；這意味著HIPK-2可能失活[23]。在HIPK-2細胞質(zhì)定位時，乳腺癌組織中還發(fā)現(xiàn)了整合素α(6)β(4)，其參與p53凋亡活性的損傷[24]，這說明HIPK-2在乳腺癌中可能是因胞質(zhì)定位而失活。Pierantoni等用RT-PCR的方法檢測了20例乳腺癌的HIPK-2基因水平，發(fā)現(xiàn)相對正常乳腺組織，HIPK-2在乳腺癌中低表達[3]。但病例數(shù)較少，且研究者未將組織標本與臨床病理資料相結(jié)合。對MDA-MB-231細胞株的體外實驗研究報道稱，HIPK-2可以通過下調(diào)vimentin，從而抑制乳腺癌的侵襲[40]。

綜上所述，HIPK-2在遺傳毒性損傷反應中誘導細胞凋亡起重要作用，深入?yún)⑴c了p53通過不同的機制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化，乙?；偷鞍踪|(zhì)構象。HIPK-2也可通過調(diào)節(jié)蛋白(如Nox1，MT2A，MDM2等)間接影響p53凋亡功能，使p53失調(diào)，導致腫瘤進展和化療耐藥。HIPK-2也能在p53無效的細胞中下調(diào)抗細胞凋亡分子，如CtBP和ΔNp63α，從而誘導細胞凋亡。HIPK-2可能通過幾種信號傳導途徑參與腫瘤進展和對治療的反應，如Wnt/β-catenin或HIF-1通路。缺氧會給HIPK-2的功能帶來負面影響，從而間接影響p53的抑癌功能。HIPK-2可經(jīng)歷突變或雜合性丟失。HIPK-2還可以控制胞質(zhì)分裂中染色體的不穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤發(fā)生。這些研究結(jié)果，展示了HIPK-2在抗腫瘤方面的重要作用，它將成為潛在的診斷標記物和治療靶標。HIPK-2是將來很有希望的抑制腫瘤的蛋白，結(jié)合HIPK-2的抑癌機制，通過研發(fā)新的藥物激活HIPK-2的功能，從而達到治療腫瘤的目的將會是一個值得探索的領域。

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