周小果

（河南省南陽市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 南陽 473000）

肺癌的致死率和發(fā)病率居全球惡性腫瘤的首位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell carcinoma，NSCLC）占肺癌的80%[1]。目前治療NSCLC的方法有手術(shù)、化療、放療等。研究表明，NSCLC患者根治術(shù)后行化療，能延長患者生存時間。臨床研究證實，細(xì)胞角蛋白19片段（keratin 19，KRT19）為肺癌腫瘤標(biāo)志物[2]。目前化療聯(lián)合分子靶向治療對晚期NSCLC患者生存時間的影響，以及KRT19基因多態(tài)性與化療聯(lián)合靶向治療預(yù)后的關(guān)系研究較少。本研究旨在探討KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)性與化療聯(lián)合靶向治療療效的相關(guān)性，為臨床治療晚期NSCLC提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2010年4月-2012年4月在河北省南陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科接受外科根治術(shù)后行化療聯(lián)合靶向治療的晚期NSCLC患者146例。其中，男性93例，女性53例；年齡51～75歲，中位年齡61歲，有吸煙史患者78例，按照國際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅲa期52例，Ⅲb期53例，Ⅳ期41例；鱗癌82例，腺癌64例。美國東部腫瘤協(xié)作組的功能狀態(tài)評分≤2分。患者在化療聯(lián)合靶向治療前，血常規(guī)和腎功能均在正常范圍內(nèi)，心電圖正常，體力狀況（Karnofsky，KPS）評分≥70分。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)或穿刺活檢病理證實，有可評估的病灶，且無其他部位腫瘤；②首次接受化療聯(lián)合靶向治療方案，治療前無血常規(guī)、肝腎功能異常，心電圖正常；③患者依從性好，簽訂知情同意書，愿意接受術(shù)后隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有嚴(yán)重的肝腎功能或造血系統(tǒng)疾?。虎趪?yán)重心腦血管疾病或精神疾?。虎垡缽男圆罨虿辉附邮茈S訪。

1.2 治療方案

146例患者采用化療聯(lián)合尼妥珠單抗靶向治療?；煼桨敢罁?jù)患者肺癌細(xì)胞類型及全身狀況制定，主要采用順鉑DDP或卡鉑CBP方案為主的化療，其中18例患者采用DDP或CBP聯(lián)合伊立替康治療；51例患者采用DDP或CBP聯(lián)合吉西他濱治療；32例患者采用DDP或CBP聯(lián)合去甲長春堿治療；30例患者采用DDP或CBP聯(lián)合紫杉醇聯(lián)合治療；15例患者DDP聯(lián)合培美曲塞二鈉聯(lián)合治療。具體用藥劑量為：第1天，DDP 75 mg/m2或者CBP曲線下面積5～6 g；第1和8天，吉西他濱1 250 mg/m2；第1天，紫杉醇135～175 mg/m2維持≥3 h；第1和8天，去甲長春堿25 mg/m2；第1天，培美曲塞二鈉500 mg/m2。在化療治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合尼妥珠單抗治療，尼妥珠單抗200 mg靜脈滴注，1次/周，連續(xù)用藥6周，6周后改為1次/2周。21 d為1個治療周期，治療4個周期。

1.3 近期療效評估

根據(jù)美國國立癌癥研究所制定的有關(guān)實體瘤的療效評定標(biāo)準(zhǔn)，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、穩(wěn)定（stable disease，SD）和進(jìn)展（progressive disease，PD）。以CR+PR，且持續(xù)時間≥24周為臨床有效。對化療聯(lián)合靶向治療有效且病灶穩(wěn)定的患者，采取停止化療和尼妥珠單抗靶向治療，進(jìn)入觀察隨訪時間，若出現(xiàn)新的病灶則需要進(jìn)行二線治療?；颊呱鏁r間指確診為肺癌至患者死亡或末次隨訪時間，隨訪截止時間為2016年5月23日。隨訪采用電話咨詢或者門診隨訪。

1.4 方法

1.4.1 外周血標(biāo)本及DNA提取 采集癌癥患者外周靜脈血5 ml，置于含EDTA的真空管中，-80℃冰箱中保存。取血樣標(biāo)本2 ml，采用基因組DNA快速提純試劑盒（美國Promega生物試劑公司）提取DNA，保存于-40℃冰箱中備用。

1.4.2 PCR-RFLP應(yīng)用 引物設(shè)計參照文獻(xiàn)[1]，由上海英駿生物科技工程有限公司合成。采用Light Scanner Primer Design軟件設(shè)計KRT19（-99G＞C）基因相應(yīng)位點引物，均采用小片段擴(kuò)增引物。KRT19（-99G＞C）（C）正向引物：5’-CCGGTACATGGCCTATTAACGTGCATACGG -3’，反向引物：5’-CGTTGCGCAATGCTGACCGATCA-3’，PCR產(chǎn)物片段長度168 bp。

1.4.3 目的基因擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為25 ml，其中含5 ml PCR Mix，正反向引物各0.5 ml，1 ml LC Green和1 ml DNA模板，剩余加入雙蒸水。KRT19（-99G＞C）的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，93℃變性30 s，55℃退火30 s，73℃延伸45 s，93℃變性 45 s，45℃退火30 s，共40個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min，限制性內(nèi)切酶為RsaⅠ。取PCR產(chǎn)物10μl于37℃酶切2 h，在含2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外線透射儀觀察PCR擴(kuò)增是否成功，鑒定其特異性。全部測序由ABI3100測序分析儀（美國ABI公司）完成。為準(zhǔn)確測定基因分型結(jié)果，隨機(jī)選取10%樣本采用直接測序法進(jìn)行驗證。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率表示，基因型頻率的觀察值與預(yù)期值行χ2檢驗及Hardy-Weinberg平衡分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，各因素水平間采用Log-rank檢驗，影響死亡的因素采用Cox比例風(fēng)險模型分析，均校正患者的性別、臨床分期、病理類型、PS評分及化療方案。統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果均為雙側(cè)概率檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRT19（-99G＞C）基因頻率

經(jīng)限制性內(nèi)切酶剪切后，KRT19（-99G＞C）存在3種基因型，其中GG型酶切產(chǎn)物片段大小為168 bp；GC型酶切產(chǎn)物片段大小為168、135和65 bp；CC型酶切產(chǎn)物片段大小為135和65 bp。PCR檢測結(jié)果顯示，GG型基因頻率為21.92%（32/146），GC型為40.41%（59/146），CC 型為 37.67%（55/146）。見圖1。

2.2 KRT19（-99G＞C）基因平衡檢測

應(yīng)用 Hardy-Weinberg定律對KRT19（-99G＞C）基因型分布行遺傳平衡檢測，KRT19（-99G＞C）位點的檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.147，P=0.112），該樣本來自同一孟德爾群體，符合遺傳平衡。

2.3 臨床因素與化療聯(lián)合靶向治療敏感性的關(guān)系

性別、年齡、吸煙史、臨床分期、病理類型、組織學(xué)分級及KPS評分對晚期NSCLC患者化療聯(lián)合靶向治療的敏感性無明顯影響（P＞0.05）。見表1。

2.4 KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)性與化療聯(lián)合靶向治療療效的關(guān)系

GG基因型患者與GC+CC基因型患者化療聯(lián)合靶向治療的有效率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；攜帶C基因型者對化療聯(lián)合靶向治療的敏感性是T基因型的1.897倍。見表2。

2.5 KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)性與生存率的相關(guān)性

至隨訪截止時間，146例晚期NSCLC患者中死亡67例，無失訪者，治療后中位生存時間（middle survival time，MST）為 22.1個月。KRT19（-99G＞C）等位基因C攜帶者（GC+CC）的MST短于GG基因型攜帶者（P＜0.05）。見表3和圖2。

2.6 Cox模型多因素分析

化療聯(lián)合靶向治療、KRT19（-99G＞C）變異等位基因C是影響晚期NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素，其變異等位基因C攜帶者（GC+CC）的是GG基因型攜帶者的2.014倍（P＜0.05）。見表4。

圖1 KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)位點的瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 臨床因素與晚期NSCLC患者化療聯(lián)合靶向治療敏感性的關(guān)系 （%）

表2 KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)性與化療聯(lián)合靶向治療療效的關(guān)系 例（%）

表3 KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)性與生存率的關(guān)系

圖2 KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)性患者的生存曲線

表4 晚期NSCLC患者預(yù)后影響因素的Cox多因素回歸分析參數(shù)

3 討論

NSCLC是全球范圍內(nèi)死亡率和致死率最高的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者確診時已屬晚期，失去最佳手術(shù)時機(jī)，因此多需要進(jìn)行內(nèi)科治療為主的綜合治療。鉑類藥物聯(lián)合吉西他濱、紫杉醇或長春見等藥物進(jìn)行化療是主要標(biāo)準(zhǔn)方案，但有效率僅為30%左右，同時個體差異等不同化療效果也不盡相同[3-4]。近年來，分子靶向治療正逐漸受到重視，其對可能導(dǎo)致細(xì)胞變惡環(huán)節(jié)，如原癌基因和抑癌基因失衡、腫瘤血管異常增生、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路等，選擇具有針對性、有效性的阻斷劑，能夠從分子水平阻止或者逆轉(zhuǎn)這種正常細(xì)胞的惡變，從而能夠抑制腫瘤生長、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[5]。本研究中化療藥物不同，主要是針對不同患者體質(zhì)，采取相應(yīng)化療方案。而分子靶向治療藥物選擇的是尼妥珠單抗，為人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的人源化單克隆抗體，能夠抑制EGFR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮生物學(xué)作用，而EGFR被認(rèn)為與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。越來越多的學(xué)者采用尼妥珠單抗聯(lián)合常規(guī)化療的方案，來治療晚期NSCLC患者，結(jié)果顯示，尼妥珠單抗不僅能夠通過阻斷EGFR，來抑制癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，同時可以增加癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[7]。這也是本研究采用化療聯(lián)合靶向治療NSCLC的主要原因。另有研究表明，尼妥珠單抗聯(lián)合常規(guī)化療方案治療晚期NSCLC患者的CR、PR、SD比例高于常規(guī)組[8]。

KRT19是一種分化特異的蛋白質(zhì)，廣泛存在于上皮細(xì)胞，是一種重要的肺癌腫瘤標(biāo)志物，對NSCLC具有重要的診斷價值，根據(jù)其分子質(zhì)量及雙向電泳等特點分析顯示，其有2個亞群，1個是酸性蛋白、1個為堿性蛋白[9]。有報道指出，尼妥珠單抗聯(lián)合三維適形放射治療晚期NSCLC能夠降低KRT19含量，此外KRT19與 EGFR 具有相關(guān)性[10]。KRT19（-99G＞C）位于KRT19基因外顯子區(qū)域內(nèi)。有報道指出（-99G＞C）基因位點G等位基因突變?yōu)镃基因后，肺癌發(fā)生率顯著增加[11]。本研究結(jié)果顯示，KRT19（-99G＞C）等位基因C攜帶者（GC+CC）的MST短于GG基因型攜帶者；Cox模型基因分析發(fā)現(xiàn)，KRT19（-99G＞C）變異等位基因A攜帶者（GC+CC）的OR是GG基因型攜帶者的2.014倍，表明KRT19（-99G＞C）基因多態(tài)性影響化療聯(lián)合靶向治療的敏感性。需要指出的是，以往研究發(fā)現(xiàn)化療治療晚期NSCLC患者的MST在8～12個月[12-13]，而本研究發(fā)現(xiàn)化療聯(lián)合靶向治療晚期NSCLC患者M(jìn)ST在22個月左右，患者生存時間延長。

綜上所述，KRT19（-99G＞C）位點基因多態(tài)性是影響晚期NSCLC患者化療聯(lián)合靶向治療預(yù)后的獨立危險因素，且與化療聯(lián)合靶向治療敏感性相關(guān)。

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