陳忠婧，仝淞銘，蘇瑞超，葛禮豪，曹陽，于德水

（1.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001；2. 江蘇省徐州市腫瘤醫(yī)院 骨科，江蘇 徐州221000；3.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 骨科，遼寧 錦州 121001）

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemiareperfusion injury，SCII）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，SCII后的病理生理過程非常復雜，主要包括自由基損傷、鈣通道開放、脂質(zhì)過氧化反應、細胞凋亡等，往往對神經(jīng)細胞造成非常嚴重的損傷，也成為后期恢復的障礙[1-2]。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶4（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV，CaMKIV）是細胞鈣通道開放后被激活的一種蛋白激酶，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其在激活細胞內(nèi)發(fā)揮重要作用，還可通過磷酸化轉錄因子環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），在神經(jīng)元長時程增強（Long-term potentiation，LTP）過程中發(fā)揮關鍵作用[3-5]。本實驗通過復制SCII模型，觀察SCII后不同時間CaMKIV基因和蛋白的表達，探討其在SCII病理變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

兔抗CaMKIV（北京博奧森公司），免疫組織化學法試劑盒和DBA購自北京中杉公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司、大連寶生生物技術有限公司。CaMKIV引物合成由日本TaKaRa公司、大連寶生生物技術有限公司完成。

1.2 實驗分組

健康成年SD雄性大鼠84只，體重（250±20）g，由遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供。動物隨機分為7組，分別為假手術組、SCII 0 d組、SCII 1 d組、SCII 3 d組、SCII 7 d組、SCII 14 d組、SCII 28 d組，每組12只。

1.3 SCII模型的復制

采用Naslund腹主動脈阻斷方法復制SCII模型。10%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后取仰臥位，無菌條件下行腹部旁正中切口，暴露腹主動脈，于左腎動脈分叉下方約0.5 cm處放置動脈夾，夾閉腹主動脈，以阻斷下方動脈無搏動為標準。阻斷30 min后取出動脈夾，腹腔臟器復位，逐層縫合。假手術組在同樣條件下手術，只暴露腹主動脈。

1.4 方法

1.4.1 取材 隨機取出各組大鼠4只，麻醉滿意后心臟灌流，取出L2～L5節(jié)段脊髓組織，于4℃、4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學染色。取每組剩余大鼠8只，麻醉滿意后，迅速取出L2～L5節(jié)段脊髓，放入EP管中，-80℃凍存，用于Western blot和qRT-PCR檢測。

1.4.2 免疫組織化學法 按5μm厚度切片，常規(guī)脫蠟。按免疫組織化學法試劑盒說明書進行操作，兔抗CaMKIV以1∶100稀釋，DBA顯色。由不了解分組情況的觀察者用聚焦光學顯微鏡，在高倍鏡下（400倍）隨機選取不同部位的6個視野，計算陽性細胞數(shù)。

1.4.3 Western blot檢測 取長約5 mm脊髓節(jié)段，加入蛋白裂解液，采用紫外分光光度計測定蛋白含量，取等量蛋白樣品，SD-PAGE電泳分離蛋白，采用半干法將蛋白條帶轉移至PVDF膜上，1% BSA封閉1 h，CaMKIV一抗（1∶300稀釋）4℃孵育過夜。TBST漂洗，兔抗IgG（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST漂洗，化學發(fā)光試劑發(fā)光、顯影。以目的條帶與內(nèi)參β-actin的吸光度（optical density，OD）值表示相對表達水平，進行半定量分析。

1.4.4 qRT-PCR Trizol法提取組織RNA，在10μl反應體系中去除基因組DNA后，在20μl反應體系中進行逆轉錄，得到cDNA。反應條件：37℃預反應15 min，85℃反應5 s。CaMKIV mRNA正向引物：5’-AGAAATCAGCCTGGTTCTTGAGCT-3’，反向引物：5’-AACTGCCTCCAGGATCTGCTTC-3’。GAPDH 正向引物 ：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。將逆轉錄后得到的cDNA樣本進行10倍梯度稀釋，向PCR管中加入20μl Master Mix反應液，以GAPDH為對照，進行PCR反應，每組重復3次。利用ABI7500 qRT-PCR系統(tǒng)，對CaMKIV基因進行qRT-PCR檢測。反應結束后，應用ABI7500分析軟件，分析目的基因擴增曲線并繪制相應的標準曲線。以GAPDH為參照基因，檢測SCII組脊髓中CaMKIV基因的表達水平，以假手術組為校準樣本，比較SCII組相對假手術組的表達差異，并用2-△△Ct法進行分析。

1.4.5 BBB評分 采用BASSO等[6]提出的BBB評分體系，處死前對各組大鼠進行神經(jīng)功能評定，總分0～21分，完全功能缺失為0分，完全正常鼠為21分，評價內(nèi)容主要包括大鼠后肢關節(jié)的運動、驅(qū)趕位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置等。評分者為3位熟悉評分標準的非本課題實驗人員，評分后取平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組脊髓組織CaMKIV陽性細胞數(shù)比較

假手術組CaMKIV蛋白表達很少；SCII組CaMKIV蛋白高表達于神經(jīng)元胞漿、胞核及軸突，其細胞呈卵圓形或三角形，于脊髓前角和中央帶相對較多。在SCII 0 d，有少量陽性神經(jīng)元散在分布于脊髓前角和中央帶；SCII 3 d，脊髓前角、中間帶及后角陽性神經(jīng)元的數(shù)目增多且著色更深；然后隨時間延長逐漸減少；至28 d，CaMKIV陽性細胞表達減少，且著色更淺。除SCII 28 d組外，其余各組脊髓組織CaMKIV陽性細胞數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=100.144，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，SCII 0 d組CaMKIV陽性細胞數(shù)高于假手術組（P＜0.05）。隨再灌注時間延長，CaMKIV陽性細胞數(shù)開始增加，3 d時達高峰后逐漸下降，至14 d時仍高于假手術組（P＜0.05）。見圖1、2。

2.2 各組脊髓組織CaMKIV蛋白表達水平比較

除28 d組外，其余各組脊髓組織CaMKIV蛋白表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=46.598，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，SCII 0 d組CaMKIV蛋白表達量高于假手術組（P＜0.05）。隨著再灌注時間延長表達量逐漸增多，3 d時達高峰，其后隨著時間延長逐漸下降，至14 d時，SCII 14 d組CaMKIV蛋白表達量仍高于假手術組（P＜0.05），至28 d時，CaMKIV蛋白表達量與假手術組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、4。

2.3 各組脊髓組織CaMKIV基因表達水平比較

圖1 大鼠脊髓組織CaMKIV陽性表達 （免疫組織化學法×400）

假手術組、SCII 0 d組、SCII 1 d組、SCII 3 d組、SCII 7 d組、SCII 14 d組、SCII 28 d組脊髓組織CaMKIV基因相對表達量分別為（1.000±0.00）、（1.228±0.135）、（1.674±0.209）、（1.863±0.216）、（1.402±0.093）、（1.258±0.119）和（1.135±0.084），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=88.057，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，SCII 0 d組CaMKIV相對表達量高于假手術組（P＜0.05）。隨再灌注時間延長，CaMKIV基因表達量開始增加，3 d時達高峰，然后逐漸下降，28 d后趨于穩(wěn)定，且高于假手術組（P＜0.05）。見圖5。

圖2 各組大鼠脊髓組織CaMKIV陽性細胞數(shù)比較（n =12，±s）

圖3 各組大鼠脊髓組織CaMKIV蛋白表達

圖4 各組大鼠脊髓組織CaMKIV蛋白表達水平比較（n =12，±s）

2.4 BBB評分

假手術組大鼠后肢功能正常，BBB評分21分，各組大鼠后肢功能評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=513.61，P=0.000）。SCII組術后即出現(xiàn)BBB評分下降，隨著時間推移，BBB評分逐漸升高，后肢功能有所恢復，至28 d處死時，BBB評分仍低于假手術組（P＜0.05）。見圖6。

圖5 各組大鼠脊髓組織CaMKIV基因表達水平比較（n =12，±s）

圖6 各組大鼠后肢功能評分 （n =12，±s）

3 討論

有關Ca2+及其作用的報道很多，Ca2+是細胞內(nèi)重要的信號轉導分子，在細胞內(nèi)信息的傳遞過程中發(fā)揮重要作用[7]。鈣調(diào)蛋白（Calmodulin ，CaM）作為鈣離子結合蛋白，其活性受Ca2+濃度的調(diào)控。當細胞受到傷害性刺激時，鈣離子內(nèi)流，造成細胞內(nèi)鈣離子超載。當細胞液內(nèi)Ca2+濃度升高到一定值時，CaM與Ca2+結合成Ca2+-CaM復合物，引起CaM構象變化。該復合物激活CaMK，使許多靶蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，改變這些蛋白活性[8-9]。大量研究表明，鈣離子信號通過CaM和CaMK家族（CaMKI、CaMKII、CaMKIV）正向或負向調(diào)節(jié)突觸的復雜性，CaMKIV作為多功能CaMK家族的成員之一，可磷酸化主要轉錄因子CREB，從而調(diào)節(jié)基因轉錄[4]。有報道認為，Ca2+可通過調(diào)節(jié)CaMKIV激活轉錄因子CREB，從而介導樹突的生長[10]。NAGENDRAN等[11]發(fā)現(xiàn)，CaMKIV是通過調(diào)節(jié)樹突的分支和伸長等具體形態(tài)特征，來調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突的復雜性，從而調(diào)控神經(jīng)元樹突的生長，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。

關于CaMKIV在SCII中的作用，目前的文獻報道較少。因其廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。RIBAR等[12]發(fā)現(xiàn)，CaMKIV基因敲除的小鼠會出現(xiàn)運動功能損害，他提出CaMKIV在維持小腦的功能中發(fā)揮重要作用。在體外實驗中，CaMKIV通過誘導小腦顆粒神經(jīng)元中鉀的丟失來抑制凋亡，從而起到保護神經(jīng)的作用[13]。SCII后，鈣信號通過細胞體進入細胞核，導致核活化，CaMKIV作為CaMK通路中的核效應器，協(xié)調(diào)轉錄應答。而HARRISON等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CaMKIV在一些神經(jīng)元亞種群的細胞質(zhì)和軸突中也有表達。本實驗通過免疫組織化學法對CaMKIV蛋白進行初步細胞定位，結果顯示CaMKIV蛋白表達于細胞漿及細胞核中，說明CaMKIV參與脊髓損傷后神經(jīng)元的病理變化，且作用部位為細胞漿及細胞核。

本實驗通過qRT-PCR對假手術組及SCII組CaMKIV基因表達的時間變化進行分析，結果顯示SCII組CaMKIV基因表達相對假手術組升高，提示SCII后可快速誘導CaMKIV基因轉錄，并促進蛋白質(zhì)合成。并通過Western blot及免疫組織化學法對CaMKIV蛋白表達的時間進行檢測，發(fā)現(xiàn)SCII可導致脊髓CaMKIV蛋白表達發(fā)生變化，呈先短暫升高，在3 d時達高峰后逐漸降低的趨勢。結果顯示，在SCII后不同時間，因脊髓損傷程度不同，CaMKIV蛋白表達也隨之發(fā)生變化，說明CaMKIV在損傷的脊髓中發(fā)揮重要作用。

本實驗僅證實，CaMKIV在SCII中的時序性表達，其參與SCII的病理變化，但具體機制尚不十分清楚。TOYODA等[4]研究表明，在CaMKIV過表達的轉基因小鼠中，大腦前扣帶回LTP增強，其通過促進蛋白質(zhì)的合成來增強LTP過程。而KOKUBO等[15]在小鼠小腦顆粒神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，CaMKIV的缺失會導致BDNF基因和蛋白表達降低。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CaMKIV可能通過調(diào)節(jié)BDNF來發(fā)揮作用。

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