馬淑偉，王 軍，單瑞后，張振忠，汝少國

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

魚類卵黃原蛋白(vitellogenin, Vtg)是目前檢測環(huán)境雌激素活性最常用的生物標(biāo)志物，其測定通常采用基于Vtg或卵黃脂磷蛋白(lipovitellin, Lv)多克隆抗體建立的酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)[1-2]。與多克隆抗體相比，單克隆抗體識(shí)別單一抗原表位，具有更高的特異性，利用單克隆抗體建立的ELISA能顯著提高檢測的精確度，可以更加準(zhǔn)確地定量Vtg[3-4]。然而，單克隆抗體的制備成本高，技術(shù)難度大，目前只開發(fā)了青鳉(Oryziaslatipes)、虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)等幾種魚類的Vtg或Lv單克隆抗體[3,5-6]。金魚(Carassiusauratus)是環(huán)境雌激素研究常用的受試生物[2,7]，研究者已經(jīng)利用多克隆抗體建立了金魚Vtg的ELISA[8-9]，但是至今未見金魚Vtg單抗ELISA的報(bào)道。同科魚類的Vtg具有相近的免疫源性，能被同科魚類Vtg抗體識(shí)別，例如鯉魚(Cyprinuscarpio)Vtg多克隆抗體常被用于檢測黑頭呆魚(Pimephalespromelas)和金魚等鯉科魚類的Vtg[1,10]，推測單克隆抗體也可以檢測同科魚類的Vtg。因此，本研究嘗試?yán)脤?shí)驗(yàn)室制備的斑馬魚Lv單克隆抗體[11]建立金魚Vtg的ELISA。

魚類Vtg ELISA建立后需要開展17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)或其它雌激素類物質(zhì)的暴露實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)方法的可靠性[12]。血漿是檢測Vtg常用的樣品[2,13]，但是血樣采集過程會(huì)對魚體造成傷害甚至死亡。隨著人們對動(dòng)物保護(hù)與福利的日益關(guān)注，開發(fā)無傷害的檢測方法引起了研究者的關(guān)注。Moncaut等[14]提出南美鯛魚(Cichlasomadimerus)體表粘液中含有Vtg，可以用作檢測樣品。因此，本研究利用建立的單抗夾心ELISA測定了E2暴露后金魚血漿和體表粘液中的Vtg含量，評價(jià)了以金魚體表粘液代替血漿，用于Vtg檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

金魚購自青島市南山花鳥蟲魚市場，體重(21.6±3.6) g、體長(9.4±0.6) cm，實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)兩周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)容器為50 L玻璃水族箱，實(shí)驗(yàn)用水為連續(xù)曝氣24 h的自來水，溶解氧為(7.0±0.1) mg·L-1，光周期(光暗比)為16∶8，每天飼喂適量金魚顆粒餌料。

1.2 金魚Vtg與Lv的純化

金魚Vtg與Lv的提取和純化采用此前實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的兩步層析法[15]。

1.3 單克隆細(xì)胞株的篩選

將對照雄魚血漿、E2誘導(dǎo)雄魚血漿、純化的金魚Vtg進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，封閉后，利用8株斑馬魚Lv單克隆抗體室溫孵育4 h；TBST洗3次后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔LgG室溫孵育4 h，TBST洗膜3次后，用DAB顯色液顯色，待條帶清晰時(shí)，用蒸餾水終止反應(yīng)。將篩選出的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 抗體的生產(chǎn)與純化

參照An等[6]的方法制備大量單克隆抗體。向小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞105個(gè)；10 d后取腹水，收集上清，純化單克隆抗體。利用Bradford法測定蛋白濃度，保存于-80 ℃。

1.5 夾心ELISA的建立與性能評價(jià)

參考Mitsui等[16]的方法，將純化的斑馬魚Lv單克隆抗體用碳酸鈉包被緩沖液(0.05 Mol/L, pH 9.6)稀釋至5 μg·mL-1后，4℃包被過夜；次日，37 ℃封閉1 h，用PBST清洗3次后，加入100 μL梯度稀釋的純化金魚Lv，37 ℃孵育1 h，隨后加入100 μL不同稀釋倍數(shù)的HRP-標(biāo)記金魚Lv多克隆抗體(1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000)，于37°C孵育1 h；最后，加入100 μL TMB單組分顯色液(Solarbio, China)，37 ℃顯色10 min，用2N H2SO4終止反應(yīng)，測定450 nm下的吸光值。

參照Nilsen等[17]與Maltais等[18]的方法測定ELISA的精確度與檢出限。精確度通過組內(nèi)差異與組間差異評價(jià)，檢出限定義為12個(gè)0標(biāo)準(zhǔn)品孔吸光值的平均值加上兩倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.6 E2對金魚Vtg的誘導(dǎo)

采用半靜態(tài)毒性試驗(yàn)方法，E2暴露濃度分別為0、10、100和1 000 ng·L-1，3、21 d后采集血樣與體表粘液。體表粘液的采集按照Maltais和Roy[19]的方法略加修改，用刀片輕輕擦拭金魚尾鰭，將刀片上粘液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，稱重，按1∶10(w∶v)加入預(yù)冷的含有抑酶肽(0.05 IU·mL-1)的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)，勻漿后，4℃ 8 000 g離心10 min，取上清。利用Western blot和ELISA檢測血漿與體表粘液中的Vtg。

1.7 數(shù)據(jù)分析

金魚(n=6)血漿與體表粘液中Vtg含量經(jīng)Tukey’s檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，當(dāng)P<0.05時(shí)，定為差異顯著，P<0.01時(shí)，定為差異極顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用SPSS軟件(version 18)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 單克隆細(xì)胞株的篩選與抗體獲取

Western blot結(jié)果顯示，H2H6、H1C8、H4C11、H3A8檢測到純化Vtg與E2誘導(dǎo)組雄魚血漿的多條清晰條帶，但與對照雄魚血漿不發(fā)生交叉反應(yīng)(見圖1)。將這4株細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用Protein G純化獲得了H2H6、H1C8、H4C11、H3A8單克隆抗體的IgG組分。

(1：純化的Vtg；2：E2誘導(dǎo)組雄魚血漿；3：對照組雄魚血漿。1: purified Vtg; 2: E2-induced male plasma; 3: control male plasma.)

圖1 Western blot測定斑馬魚Lv單克隆抗體對金魚Vtg的特異性
Fig.1 Specificity ofanti-zebrafish Lvmonoclonal antibodies to goldfish Vtg by Western blot analysis

2.2 夾心ELISA的建立

以純化的4種單抗分別包被酶標(biāo)板，以HRP標(biāo)記的金魚Lv多抗(稀釋倍數(shù)為10 000倍)為檢測抗體建立了夾心ELISA。以單抗H2H6與H4C11包被時(shí)，金魚Lv標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值很低，且不呈線性；在利用單抗H3A8與H1C8建立的ELISA中，金魚Lv的吸光值較高，具有較好的線性，相比之下，在基于單抗H3A8建立的夾心ELISA中Lv曲線的斜率更大(見圖2)。

當(dāng)單抗H3A8包被濃度為5 μg·mL-1時(shí)，不同稀釋倍數(shù)HRP標(biāo)記抗體獲得的曲線如圖3A所示。當(dāng)HRP標(biāo)記抗體稀釋1∶10 000時(shí)，曲線具有很寬的工作范圍，呈現(xiàn)較好的線性，并且最大吸光值在3.0左右，在該反應(yīng)條件下，ELISA的工作范圍為15.6～1 000 ng·mL-1(y=1.664 9x-2.106 2，R2=0.990 4)，檢出限為9.6 ng·mL-1(見圖3B)。

圖2 利用夾心ELISA篩選單克隆抗體Fig.2 Screening monoclonal antibody by sandwich ELISA

圖3 HRP標(biāo)記抗體稀釋倍數(shù)的確定(A)與夾心ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig. 3 Determination of the optimal dilution of HRP-labeled antibody (A) and a standard curve of sandwich ELISA (B)

利用單抗H3A8建立的夾心ELISA同時(shí)檢測了純化的金魚Vtg與Lv，發(fā)現(xiàn)它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎重合(見圖4)。

圖4 金魚Vtg和Lv免疫同源性檢測Fig. 4 Test of immunologic similarities between goldfishVtg and Lv

利用Lv標(biāo)準(zhǔn)品測定了ELISA的精確度。其組內(nèi)差異為1.30%～4.99%，組間差異為2.30%～4.37%(見表1)，均低于5%。

表1 ELISA組內(nèi)差異與組間差異的測定

2.3 E2暴露對金魚血漿與體表粘液Vtg的誘導(dǎo)

2.3.1 E2暴露3 d Western blot結(jié)果顯示，單抗H3A8在對照組、10和100 ng·L-1E2暴露3 d后的雄魚血漿、體表粘液均未檢測到Vtg條帶；在1 000 ng·L-1暴露組雄魚血漿、體表粘液均檢測到兩條與純化Vtg相同的條帶(見圖5)。

(1：對照組；2：10 ng·L-1組；3：100 ng·L-1組；4：1000 ng·L-1組；5：純化的金魚Vtg。Land 1: control; land 2: 10 ng·L-1; land 3: 100 ng·L-1; land 4: 1 000 ng·L-1; land 5:purified goldfishVtg.)

圖5 Western blot檢測E2暴露3 d后雄魚血漿(A)和體表粘液(B)中的Vtg.
Fig.5 Vtg inductionin plasma(A)and surface mucus(B) of male goldfish exposed to E2for 3 days detected by Western blot

對照組、10 ng L-1和100 ng L-1E2暴露3 d后的雄魚血漿和體表粘液均未檢測到Vtg，1 000 ng L-1暴露組雄魚血漿和體表粘液中Vtg含量分別為(168.5±32.2) μg·mL-1和(9.9±1.7)μg·mL-1，顯著高于對照組(P<0.01，見圖6)。

2.3.2 E2暴露21 d Western blot結(jié)果顯示，對照組與10 ng·L-1E2暴露21 d后的雄魚血漿和體表粘液未檢測到Vtg條帶，100 ng·L-1E2暴露組雄魚血漿檢測到兩條帶，1 000 ng·L-1E2暴露組出現(xiàn)了多條清晰條帶(見圖7A)。100和1 000 ng·L-1E2暴露組雄魚體表粘液檢測到2條清晰條帶及1條較弱條帶(見圖7B)。

ELISA結(jié)果顯示，對照組與10 ng·L-1E2暴露組雄魚血漿和體表粘液中未檢測到Vtg，100與1 000 ng·L-1E2暴露后雄魚血漿Vtg含量顯著升高至(14.6±4.7)、(1 216.0±525.2)μg·mL-1(P<0.01，見圖8A)。100與1 000 ng·L-1暴露組雄魚體表粘液中的Vtg含量顯著升高至(17.2±0.2)、(288.53±125.6)μg·mL-1(P<0.01，見圖8B)。

圖6 利用ELISA測定不同濃度E2暴露3 d后雄性金魚血漿(A)和體表粘液(B)中的Vtg濃度Fig. 6 Vtgconcentrations in plasma (A) and surface mucus(B) of male goldfishexposed to different E2for 3 daysdetected by ELISA.

3 討論

本研究利用斑馬魚Lv單克隆抗體建立了金魚Vtg的夾心ELISA，為金魚Vtg的檢測提供了新的方法。Western blot結(jié)果顯示，單抗H2H6、H1C8、H4C11、H3A8能夠檢測到E2誘導(dǎo)組雄魚血漿與純化Vtg的陽性條帶，但是與對照組雄魚血漿無交叉反應(yīng)，表明它們對金魚Vtg具有很高的特異性，這與斑馬魚Vtg的研究結(jié)果相近[20]；并且金魚Vtg在以上4種單抗的檢測下都顯示一條清晰的主帶與多條弱帶，這與金魚Vtg多克隆抗體的Western blot結(jié)果相一致[21]，表明斑馬魚Lv單抗能夠識(shí)別金魚Vtg的多個(gè)亞基，可以用于金魚Vtg的檢測。ELISA的結(jié)果顯示單抗H3A8對金魚Lv具有更寬的檢測范圍，且斜率明顯高于其它抗體，表明該抗體對金魚Lv具有更高的親和力。以單抗H3A8為包被抗體，以純化的金魚Lv為標(biāo)準(zhǔn)品，以HRP標(biāo)記金魚Lv多克隆抗體為檢測抗體建立了夾心ELISA，發(fā)現(xiàn)金魚Vtg與Lv的標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎完全重合，可見單抗H3A8對金魚Vtg與Lv具有相同的結(jié)合能力；ELISA的組內(nèi)與組間差異均低于5%，低于金魚Vtg多克隆抗體建立的ELISA方法[21]，表現(xiàn)出很高的精確度。以上結(jié)果證實(shí)基于斑馬魚Lv單克隆抗體建立的夾心ELISA能夠準(zhǔn)確定量金魚Vtg。本研究建立的ELISA工作范圍為15.6～1 000 ng·mL-1，檢出限約為9.6 ng·mL-1，與鯉魚和紋鱧(Channastriata)等魚類Vtg ELISA的研究結(jié)果相近[22-23]， 但是高于金魚Vtg多克隆抗體建立的ELISA[21]。為進(jìn)一步提高檢測方法的敏感度，今后有必要開發(fā)金魚Vtg的單克隆抗體。

(1：對照組；2：10 ng·L-1組；3：100 ng·L-1組；4：1 000 ng·L-1組；5：金魚Vtg。Land 1: control; land 2: 10 ng·L-1; land 3: 100 ng·L-1; land 4: 1 000 ng·L-1; land 5: goldfish Vtg.)

圖7 Western blot檢測E2暴露21 d后雄魚血漿(A)和體表粘液(B)中的Vtg
Fig.7 Vtg induction in plasma (A)and surface mucus (B) of male goldfish exposed to E2for 21 days detected by Western blot

有研究報(bào)道魚類血漿與體表粘液中的Vtg含量在外源雌激素的誘導(dǎo)下存在正相關(guān)性[18,24]，并且魚類體表粘液取樣較血漿取樣方便，對魚體沒有傷害，更適合用作Vtg的檢測樣品[24-25]。為檢驗(yàn)金魚體表粘液中的Vtg是否能夠有效指示外源化合物的雌激素活性，本研究利用建立的ELISA測定E2暴露后雄性金魚血漿和體表粘液中的Vtg含量。E2的環(huán)境濃度通常在5～199.0 ng/L之間[26-27]，本研究據(jù)此設(shè)計(jì)了E2的暴露濃度為10、100與1 000 ng·L-1。檢測結(jié)果顯示，100與1 000 ng·L-1E2暴露21 d能誘導(dǎo)雄性金魚血漿產(chǎn)生Vtg，這與E2對斑馬魚Vtg的誘導(dǎo)結(jié)果相一致[28]，證明基于斑馬魚Lv單抗建立的ELISA能夠用于檢測外源化合物對金魚的雌激素活性。此前，有研究報(bào)道腹腔注射E2能夠誘導(dǎo)雄性羅非魚(Oreochromismossambicus)和金魚體表粘液產(chǎn)生Vtg[21,29]。本研究在1 000 ng·L-1E2暴露3 d、100和1 000 ng·L-1E2暴露21 d后雄魚體表粘液檢測到了Vtg，表明E2水體暴露同樣會(huì)誘導(dǎo)金魚體表粘液生成Vtg。在1 000 ng·L-1E2暴露3 d時(shí)，雄魚血漿中Vtg含量遠(yuǎn)高于體表粘液，約為體表粘液Vtg含量的17倍，但是100 ng·L-1E2暴露21 d后雄魚血漿中Vtg的含量是體表粘液的1.2倍，可見在外源化合物質(zhì)長期暴露下，體表粘液與血漿中的Vtg含量更為接近，可以有效指示外源化合物的雌激素活性。

圖8 利用ELISA測定不同濃度E2暴露21 d后雄魚血漿(A)和體表粘液(B)的Vtg濃度Fig.8 Vtg concentrations in plasma (A) and surface mucus (B) of male goldfish exposed to different E2 for 21 days detected by ELISA

綜上，本研究首次建立了金魚Vtg的單抗夾心ELISA，并且發(fā)現(xiàn)金魚體表粘液Vtg可以用作環(huán)境雌激素的無傷害檢測指標(biāo)，為金魚Vtg指標(biāo)在環(huán)境雌激素研究中應(yīng)用提供了重要的方法學(xué)參考。

[1] Ishibashi H, Tachibana K, Tsuchimoto M, et al. In vivo testing system for determining the estrogenic activity of endocrine-disrupting chemicals (EDCs) in goldfish (Carassiusauratus)[J]. Journal of Health Science, 2001, 47(2): 213-218.

[2] Deguchi Y, Wu N X, Toyoizumi T, et al. Application of a new bioassay technique using goldfish for assessment of water toxicity[J]. Environmental Toxicology, 2008, 23(6): 720-727.

[3] Kordes C, Rieber E P, Gutzeit H O. An in vitro vitellogenin bioassay for oestrogenic substances in the medaka (Oryziaslatipes)[J]. Aquatic Toxicology, 2002, 58(3): 151-164.

[4] Luo W, Zhou Q, Jiang G. Development of enzyme-linked immunosorbent assays for plasma vitellogenin in Chinese rare minnow(Gobiocyprisrarus)[J]. Chemosphere, 2011, 84(5): 681-688.

[5] Marx A, Sherry J, Hansen P D, et al. A new monoclonal antibody against vitellogenin from rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)[J]. Chemosphere, 2001, 44(3): 393-399.

[6] An L, Hu J, Zhu X, et al. Crucian carp (Carassiuscarassius) VTG monoclonal antibody development and application[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2007, 66(2): 148-153.

[7] Yan Z, Lu G, Liu J, et al. An integrated assessment of estrogenic contamination and feminization risk in fish in Taihu Lake, China[J]. Ecotoxicology and environmental safety, 2012, 84: 334-340.

[8] Wang J, Wang W, Zhang X, et al, Development of a lipovitellin-based goldfish (Carassiusauratus) vitellogenin ELISA for detection of environmental estrogens[J]. Chemosphere, 2015, 132: 166-171.

[9] 邴欣.金魚卵黃原蛋白多克隆抗血清制備及在內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)檢測中的應(yīng)用[D].青島: 中國海洋大學(xué), 2006: 31-42.

Bingxin.Preparation of Polyclonal Antiserum Against Goldfish Vitellogenin and Its Application in Studies of Endocrine Disrupting Chemicals. [D]. Qingdao: Ocean University of China, 2006: 31-42.

[10] Mylchreest E, Snajdr S, Korte J J, et al. Comparison of ELISAs for detecting vitellogenin in the fathead minnow (Pimephalespromelas)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2003, 134(2): 251-257.

[11] Wang J. Wang W, Tian H, et al.A novel enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-lipovitellin monoclonal antibodies for quantification of zebrafish (Daniorerio) vitellogenin [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2017, 136: 78-83.

[12] Ishibashi H, Tachibana K, Tsuchimoto M, et al. In vivo testing system for determining the estrogenic activity of endocrine-disrupting chemicals (EDCs) in goldfish (Carassiusauratus)[J]. Journal of Health Science, 2001, 47(2): 213-218.

[13] Brodeur J C, Woodburn K B, Zhang F, et al. Plasma sampling and freezing procedures influence vitellogenin measurements by enzyme-linked immunoassay in the fathead minnow (Pimephalespromelas) [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2006, 25(2): 337-348.

[14] Moncaut N, Nostro F L, Maggese C. Vitellogenin detection in surface mucus of the South American cichlid fishCichlasomadimerus(Heckel, 1840) induced by estradiol-17β. Effects on liver and gonads[J]. Aquatic Toxicology, 2003, 63(2): 127-137.

[15] Wang J, Bing X, Yu K, et al. Preparation of a polyclonalantibody against goldfish (Carassiusauratus) vitellogenin and its application todetect the estrogenic effects of monocrotophos pesticide [J]. Ecotoxicol Environ Safe, 2015, 111: 109-116.

[16] Mitsui N, Tooi O, Kawahara A. Sandwich ELISAs for quantification ofXenopuslaevisvitellogenin and albumin and their application to measurement of estradiol-17βeffects on whole animals and primary-cultured hepatocytes [J]. Comp Biochem Physiol C, 2003, 135(3): 305-313.

[17] Nilsen B M, Karin B, Eidem J K, et al. Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2004, 378(3): 621-633.

[18] Maltais D, Roy R L, Couillard C M. Hybrid ELISAs for vitellogenins of the endangered copper redhorseMoxostomahubbsiand the shorthead redhorseMoxostomamacrolepidotum(Cypriniformes, catostomidae)[J]. Ecotoxicol Environ Safe, 2010, 73(5): 883-892.

[19] Maltais D, Roy R L.A lateral flow immunoassay for rapid evaluation of vitellogenin levels in plasma and surface mucus of the copperred horse(Moxostomahubbsi)[J]. Environ Toxicol Chem, 2007, 26, 1672-1676.

[20] Wang J, Zhang X N, Shan R H, et al. Lipovitellin asan antigen to improve the precision of sandwich ELISA for quantifying zebrafish(Daniorerio) vitellogenin [J]. Comp Biochem Physiol, 2016, 185C: 87-93.

[21] Wang J, Shan R H, Zhang X N, et al.Development of a lipovitellin-based sandwich ELISA for quantificationof vitellogenin in surface mucus and plasma of goldfish (Carassiusauratus)[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2015, 120: 80-87.

[22] Hennies M, Wiesmann M, Allner B, et al. Vitellogenin in carp (Cyprinuscarpio) and perch (Percafluviatilis): Purification, characterization and development of an ELISA for the detection of estrogenic effects[J]. Science of the Total Environment, 2003, 309(1): 93-103.

[23] PrakashO, Goswami SV, et al. Establishment of ELISA for murrelvitellogenin and choriogenin, as biomarkers of potential endocrine disruption[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, 2007, 146: 540-551.

[24] Meucci V, Arukwe A. Detection of vitellogenin and zona radiata protein expressions in surface mucus of immature juvenile Atlantic salmon (Salmosalar) exposed to waterborne nonylphenol[J]. Aquatic Toxicology, 2005, 73(1): 1-10.

[25] Maltais D, Roy R L. Purification and partial characterization of vitellogenin from shorthead redhorse (Moxostomamacrolepidotum) and copper redhorse (Moxostomahubbsi) and detection in plasma and mucus with a heterologous antibody[J]. Fish PhysiolBiochem, 2009, 35(2): 241-254.

[26] Manickum T, John W, Terry S. Determination of selected steroid estrogens in treated sewage effluent in the Umsunduzi (Duzi) River water catchment area[J]. Lecture Notes in Statistics, 2011, 2(3): 139-195.

[27] ManickumT, John W. Occurrence, fate and environmental risk assessment of endocrine disrupting compounds at the wastewater treatment works in Pietermaritzburg (South Africa)[J]. Science of the Total Environment, 2014, s 468-469(1): 584-597.

[28] Wang J, Zhao F, Shan R H, et al. Juvenile zebrafish in the vitellogenin blank period as an alternative test organism for evaluation of estrogenic activity of chemicals[J]. Environ Toxicol Chem, 2016, (35): 1783-1787.

[29] Kishida M, Jennifer L.Vitellogenin in the surface mucus of tilapia(Oreochromismossambicus): Possibility for uptakeby the free-swimming embryos[J]. Experimental Zoology, 1994, 268: 259-268.