易傳安，唐根云，劉立亞，汪冶

（湖南醫(yī)藥學(xué)院1醫(yī)學(xué)形態(tài)實驗中心，2檢驗醫(yī)學(xué)院，3民族醫(yī)藥研究中心，懷化 418000）

腦血管缺血性疾病是由缺血、急慢性缺氧等因素導(dǎo)致腦組織損害所致，出現(xiàn)頭暈、肢體麻木、乏力等癥狀，嚴重者具有語言、思維、計算、學(xué)習(xí)記憶、情感等功能下降。其發(fā)病機制雖有興奮性氨基酸毒性、Ca2+超載、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等眾多學(xué)說，但一直未能詳細闡明[1-4]。在治療上主要針對腦細胞保護藥如谷氨酸受體拮抗劑、自由基清除劑、鈣通道拮抗劑等方法[5-8]，但效果不甚理想。解偶聯(lián)蛋白UCP4是位于細胞線粒體內(nèi)膜上的一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白，可通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位、抑制活性氧生成、維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)，對神經(jīng)系統(tǒng)起保護作用。何首烏主要含有蒽醌、二苯乙烯苷、卵磷脂等成分，能降低血脂，抗動脈粥樣硬化，增加衰老大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)如5-羥色胺、多巴胺的含量，增強超氧化物歧化酶活性，消除自由基對機體的損傷，對缺血性腦血管疾病具有緩解癥狀，神經(jīng)保護作用[9-10]。何首烏對腦缺血再灌注損傷及UCP4表達有無影響，目前未見報道。因此，本實驗采用何首烏提取物干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠，研究腦內(nèi)UCP4的表達變化，進一步探討腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制，為何首烏治療腦缺血性血管疾病提供新靶點和新方法。

材料和方法

1 動物和分組

SD大鼠128只，雄性，體重220～260g，由安徽省實驗動物中心提供。合格證號：SCXK（皖）2011-002。腦缺血再灌注損傷實驗：大鼠隨機分成二批，每批分對照組（假手術(shù)組）和模型組，其中模型組又分成腦缺血2h再灌注6h損傷和腦缺血2h再灌注24h損傷組，每組8只。藥物干預(yù)實驗：大鼠隨機分成二批，每批分對照組（假手術(shù)組）、模型組和缺血再灌注后何首烏提取物低、中、高干預(yù)組，每組8只；各干預(yù)組在缺血再灌注6h或24h后每天分別灌胃不同濃度何首烏口服液，連續(xù)7d。實驗中死亡脫失的動物和造模后不符合模型判定標準的都不計算在內(nèi)。

2 主要試劑

何首烏提取物由湖南醫(yī)藥學(xué)院民族醫(yī)藥研究中心贈送。 UCP-4多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc，USA)； SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；水合三氯乙醛（上?；瘜W(xué)試劑公司）；

3 主要實驗儀器

SpectraMax 190型全波長酶標儀（美國MD公司）， LG10-2.4A型超速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），熒光顯微鏡（日本尼康公司），-80℃超低溫冰箱（日本三洋電子有限公司），Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海市歐翔科學(xué)儀器有限公司），電泳儀與轉(zhuǎn)移電泳槽（美國Bio Rad公司）。

4 何首烏提取物的制備和使用

何首烏提取物劑量低、中、高三組分別按6.25g、12.50g和25.00g浸膏溶于50ml水中，配制成125mg/ml、250 mg/ml和500mg/ml濃度的口服液。按1ml/100g/d劑量術(shù)后口服灌胃，每天一次，共計7d。

5 大鼠局灶性腦缺血模型的建立

腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉大鼠，仰臥固定，頸正中切口，依次暴露并分離右頸總動脈，右頸內(nèi)動脈、頸外動脈，分別置4-0號線備用。結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，在頸內(nèi)、頸外動脈分叉處開口，將經(jīng)石蠟處理的尼龍線插入頸內(nèi)動脈，插入長度以分叉處計約18mm～20mm。結(jié)扎頸內(nèi)動脈，固定尼龍線，縫合。在缺血2h后，分別固定大鼠，將尼龍線抽拉出至頸內(nèi)、外動脈分叉處，實現(xiàn)再灌注。按Bederson的方法對大鼠的神經(jīng)功能缺損進行評分[11]。選取得分1～3分的大鼠為成功模型，剔除未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙以及昏迷或者死亡的大鼠。腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4表達實驗，在腦缺血2h再灌注6h和腦缺血2h再灌注24h后處死大鼠。何首烏干預(yù)實驗，在腦缺血2h再灌注24h后喂藥7d，每天一次，第7d后處死大鼠。

6 腦組織梗死面積的測定

建模成功后，大鼠在灌服何首烏最末一次60min后，立即斷頭取腦，去除嗅球、小腦及低位腦干后，腦組織放于-20℃冰箱中，冷凍20min，取出后間隔3mm連續(xù)做冠狀切片，置于1%TTC磷酸緩沖液中，37℃下恒溫避光孵育30min，正常組織染成紅色，梗塞灶染成白色，腦片置4%多聚甲醛固定，數(shù)碼相機拍照，采用Image J 分析梗死面積和總面積，記錄梗死面積占總面積的百分比。梗死面積百分比（%）＝蒼白區(qū)面積/腦片面積×100%。

7 UCP4免疫組織化學(xué)染色

大鼠腦缺血2h再灌6h或腦缺血2h再灌注24h后立即斷頭處死，取腦進行石蠟包埋；石蠟切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后，PBS浸泡切片5 min；3%過氧化氫室溫孵育5min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，每次2min；在切片上滴加10%正常山羊血清（PBS緩沖液稀釋），放置在濕盒中，室溫孵育10～15min，以封閉游離的結(jié)合位點，減少非特異性染色；甩去多余山羊血清，勿洗，滴加抗UCP4一抗，4℃孵育過夜；PBS漂洗3次，每次2min；滴加生物素標記的二抗（羊抗兔lgG工作液），37℃孵育30min；PBS漂洗3次，每次2min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20min；PBS漂洗3次，每次2min； DAB顯色后蘇木精染液染色5 min，蒸餾水沖洗后脫水、透明、封片。

8 UCP4的Western blot檢測

斷頭處死大鼠，取腦放入勻漿器，按1g∶10ml加入裂解液，碾碎后置于冰上裂解30min。將裂解好的蛋白移入1.5ml離心管中4℃高速離心機中，10000r/min離心15min。上清液移入EP管中，-80℃保存。將所提蛋白按與上樣緩沖液按體積1∶4進行混合后置于金屬浴槽內(nèi)100℃變性10min。經(jīng)10%SDSPAGE電泳后，再進行轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%牛奶封閉液室溫1h。用TBST（Tris-HCl緩沖液 100ml，Nacl 87.6g，Tween20 5ml，蒸餾水1000ml）洗3次，每次5min。滴加UCP4抗體4℃過夜。用TBST洗膜3次（每次5min）后，用二抗稀釋液按說明書上的倍數(shù)稀釋相對應(yīng)的二抗，室溫下孵育1h，TBST洗3次膜（每次5min）后加ECL孵育，Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影，用Image J軟件對蛋白條帶光密度進行定量分析，以UCP4條帶光密度與β-actin條帶光密度比值代表UCP4相對水平。

9 統(tǒng)計方法

利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對資料進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差來描述，用方差分析進行多組間UCP4指標表達水平的比較，SNK-q檢驗法進行各組間的兩兩比較，P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腦缺血再灌注損傷早期大鼠腦內(nèi)UCP4水平上調(diào)

免疫組織化學(xué)染色顯示，UCP4在正常大鼠腦組織內(nèi)UCP4免疫反應(yīng)性較弱，免疫陽性產(chǎn)物位于胞質(zhì)內(nèi)（圖1A）。腦缺血2h再灌6h后UCP4免疫組織化學(xué)陽性產(chǎn)物明顯增多（圖1B），再灌注24h后UCP4免疫組織化學(xué)表達增加不明顯（圖1C）。Western blot實驗顯示，腦缺血再灌注6h組，UCP4蛋白水平明顯增加，再灌注24h組UCP4表達與對照組相近（圖1D）。

圖1 腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)UCP4表達變化。A-C，UCP4表達的免疫組織化學(xué)檢測（比例尺：20μm）；A，對照組；B，缺血再灌注6h組；C，缺血再灌注24h組；D，UCP4表達的Western blot檢測；E，Western blot檢測的UCP4表達水平的統(tǒng)計學(xué)分析；*，P＜0.01Fig.1 Changes of UCP4 expression level in the cerebral cortex with ischemia reperfusion injury of the rats. A to C, UCP4 expression detected by immunohistochemistry (scale bar, 20μm); A, control group (Ctrl); B, ischemia reperfusion for 6h group (6h); C, ischemia reperfusion for 24h group (24h);D, UCP4 expression detected by Western blot; E, statistical analysis for UCP4 expression level detected by Western blot; *, P＜0.01

2 何首烏干預(yù)減少腦缺血再灌注損傷大鼠腦損傷面積

在腦缺血2h再灌注6h后，按1ml/100g/d不同濃度的何首烏口服液術(shù)后灌胃干預(yù)，連續(xù)7d后處死大鼠進行TTC染色分析。結(jié)果顯示，何首烏低濃度（125mg/ml）組腦缺血損傷面積較大，較未干預(yù)的模型組略減小，中濃度（250 mg/ml）組損傷面積明顯減小，高濃度（500mg/ml）組損傷面積減小更為明顯（圖2）。說明何首烏能減輕腦缺血再灌注損傷所致腦組織壞死。

圖2 何首烏提取物對腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)損傷面積的影響。中、高濃度何首烏能顯著減輕腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)損傷。*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig.2 Effect of polygonum multi florum extract on the injured area of cerebral cortex with ischemia reperfusion injury of the rats. PME-M and PME-H could alleviate the cortical damage after ischemia reperfusion injury. *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

3 何首烏上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠腦內(nèi)UCP4蛋白水平

在大鼠腦缺血2h再灌注24h服用何首烏提取物， Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠UCP4表達水平與對照組相近，何首烏干預(yù)后UCP4的表達濃度隨藥物濃度的增加而增高。當(dāng)何首烏提取物為125mg/ml 時，UCP4表達最低，當(dāng)濃度為500mg/ml時，UCP表達最高。說明經(jīng)何首烏干預(yù)后，腦缺血再灌注急性損傷UCP4水平逐漸恢復(fù)并高于正常（圖3）。

討 論

1 UCP4蛋白在腦缺血再灌注損傷的保護作用

通過免疫組織化學(xué)和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)：腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4在腦缺血再灌注損傷6h表達升高，缺血再灌注24h表達恢復(fù)至對照組水平。由此提示腦缺血再灌注損傷早期UCP4表達增高，后期表達降低。運用何首烏提取物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)該藥能減少腦缺血再灌注損傷的面積，提高UCP4在腦組織的表達，并且UCP4的表達隨藥物濃度的增加而增強。

圖3 何首烏提取物對腦缺血再灌注損傷大鼠腦內(nèi)UCP4表達的影響。PME-L，低濃度何首烏提取物；PME-M，中濃度何首烏提取物；PME-H，高濃度何首烏提取物；*，P＜0.01；**，P＜0.001Fig.3 Effect of polygonum multi florum root extract on the expression of UCP4 in the cortex with cerebral ischemia reperfusion injury of the rats.PME-L, low concentration of polygonum multi florum extract; PME-M, medium concentration of polygonum multi florum extract; PME-H, high concentration of polygonum multi florum extract; *, P＜0.01; **, P＜0.001

UCP4蛋白在腦缺血再灌注6h后腦組織內(nèi)表達增高，再灌注24h后表達降低；這與王麗榮等報道的原代培養(yǎng)神經(jīng)元類缺血再灌注損傷后表達結(jié)果相反[13]，但與曲方等大鼠腦缺血后腦組織UCP4表達情況一致[14]。本研究可能由于腦組織急性缺血、缺氧導(dǎo)致線粒體發(fā)生功能障礙，而氧化損傷是線粒體功能障礙的主因；同時線粒體內(nèi)UCP4蛋白被激活，表達上調(diào)，在神經(jīng)細胞內(nèi)表達增多，使腦組織缺血反應(yīng)減輕，提示UCP4對腦組織具有保護作用。神經(jīng)元類缺血再灌注損傷由于氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，活性氧ROS產(chǎn)生增多，可能導(dǎo)致腦內(nèi)合成的UCP4蛋白減少，提示UCP4可能參與了腦損傷的病理過程，其作用機制須進一步研究。資料表明UCP2基因敲除小鼠會加重腦缺血再灌注損傷[15-16]。UCP4蛋白能使線粒體增殖，減少氧化損傷，保護線粒體膜電位，維持ATP水平[17-18]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，UCP4和UCP2蛋白可以調(diào)節(jié)線粒體ROS產(chǎn)量，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。本研究證實UCP4在腦缺血再灌注損傷后早期表達增強，后期表達降低，經(jīng)何首烏干預(yù)治療后表達增高。我們推測UCP4是細胞內(nèi)一種抗氧化損傷蛋白，對線粒體和細胞起保護作用。目前證明，腦梗塞患者發(fā)病后血液中UCP4蛋白的表達增高，腦組織SOD活性降低，MDA含量升高[19]，表明UCP4在腦梗塞中參與了線粒體氧化代謝作用。

2 何首烏提取物對腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4的影響

生首烏能解毒、消癰、潤腸通便，制首烏能補肝腎、益精血、烏發(fā)、強筋骨。現(xiàn)代中醫(yī)臨床上何首烏常用于治療高脂血癥。據(jù)報道何首烏提取物在抗皮膚衰老和大腦衰老、抗高脂血癥、抗動脈粥樣硬化和抗老年性癡呆等方面發(fā)揮重要作用[9]。近來報道，何首烏提取物對Alzheimer病Ach酶活性有明顯的增強作用和提高BDNF因子含量，促進學(xué)習(xí)記憶能力提高[21-22]。解偶聯(lián)蛋白UCP4是位于細胞線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白，使細胞氧化磷酸化過程解偶聯(lián)作用，ATP產(chǎn)生減少。何首烏對腦組織線粒體解偶聯(lián)蛋白UCP4是否有影響，能否作為何首烏藥物治療的靶蛋白，資料少有報道。本實驗?zāi)X缺血再灌注損傷大鼠服用何首烏后UCP4表達濃度增高，其作用機制可能是何首烏能提高腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4蛋白的合成，降低線粒體ROS的產(chǎn)生，消除自由基對機體的損傷，減緩線粒體功能障礙。對于UCP4的神經(jīng)保護作用，尚缺少在基因摘除條件和抑制劑作用下，何首烏對腦缺血再灌注損傷的影響，目前需進一步完善。綜上所述，何首烏提取物可能通過合成腦內(nèi)線粒體UCP4的含量，提高UCP4的表達，發(fā)揮腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。