唐 偉，李佩洪，龔 霞，陳 政,楊代宇(四川省植物工程研究院，四川 資中 641200)

花椒是蕓香科以種子繁殖的落葉灌木或小喬木，是我國重要的經濟樹種之一。由于經濟價值較高，我國對花椒的研究頗多，花椒優(yōu)良品種的培育，花椒病害的預防，花椒的采收及加工是目前花椒研究的主要方向。目前雖然有一些花椒人工育成品種，但遠不能滿足生產的需求。因此開辟花椒育種新途徑具有重大研究意義。

化學誘變育種是利用化學誘變劑人工誘發(fā)植物發(fā)生變異，在分離后代中對突變體進行篩選和鑒定，培育出生產上能直接或間接利用的農作物品種的方法。這種方法已經廣泛應用于大豆、玉米、水稻、油菜、花卉、蔬菜、杉木、茶樹等植物育種，還應用于部分微生物育種上。但是，目前僅有一篇碩士論文關于花椒化學誘變育種方面的相關研究。薛惠丹等人以鳳縣大花炮花椒的愈傷組織為材料，以EMS為誘變劑進行人工誘變試驗?；ń窞閱涡越Y實，屬于無融合生殖，不易進行雜交育種，在此之前對花椒的相關育種研究都是采取自然狀態(tài)下的優(yōu)選育種，進行新材料選育的時間太長，且沒有目的性，育種效果不佳。因此，利用化學誘變的方法對花椒進行育種研究，克服選擇育種方法的局限性，增加遺傳物質變異重組幾率、縮短育種周期、提高育種效率變得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 誘變材料的選擇

植物的各個部分都可作為誘變材料，但為了獲得較高的突變頻率和保證植物能進一步生長發(fā)育，最終產生新的個體，選擇合適的誘變材料是誘變育種的關鍵之一，所以根據(jù)處理材料的性質和誘變方法我們選擇花椒種子作為誘變材料。它的優(yōu)點是操作方便，可以大量處理，處理后可在較長一段時間內持續(xù)保持生物學效應。另外，種子對環(huán)境適應能力強，可以在高溫、低溫、高真空等惡劣條件下進行誘變處理。

1.1.1 誘變材料 花椒材料選擇目前主栽品種青花椒(九葉青)種子作為處理對象。

1.1.2 誘變種子數(shù)量 4種藥劑處理，3個催芽時間處理，3個誘變時間處理，3個對照組。每個處理1000粒，一共需要的種子量為：1000×[(3×3×4)+3]=39000粒。

1.1.3 誘變劑的選擇

1.1.3.1 EMS(甲基磺酸乙酯) EMS誘變誘發(fā)突變頻率高，有益變異多，對處理材料損傷較小，而產生的突變多為點突變，染色體畸變相對較少，可以針對植物某一性狀進行有效改良。

1.1.3.2 NaN3(疊氮化鈉) NaN3是一種點突變劑，具有高效、無毒、價格便宜、使用安全等優(yōu)點。

1.1.3.3 PYM(平陽霉素) PYM是一種新的誘變劑，在許多實驗中均被證明為具有安全，高效，誘變頻率高、范圍大等特點。

1.1.3.4 秋水仙素 秋水仙素的分子結構與基因分子的堿基相似，它在不妨礙基因復制的情況下組成基因的成分參入到基因分子中去。但由于秋水仙素中的取代基與正常堿基不同，所以它在參入基因分子時或以后，會使基因復制時發(fā)生偶然配對上的差錯，從而導致基因突變。

1.2 誘變處理方法

1.2.1 誘變種子的處理 由于花椒種子外殼有一層蠟質層，需要先用紗布包裹搓洗，將蠟質層去掉。然后在培養(yǎng)箱里浸潤催芽，溫度28℃，濕度60%，催芽時間7～21d，觀察到種子開始破殼萌動立即進行分批誘變處理。

1.2.2 誘變劑的配制

1.2.2.1 EMS 在通風廚中用0.06mol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液配制濃度為0.8%的EMS溶液。

1.2.2.2 NaN3在通風廚中用0.06mol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液配制濃度為0.8%的NaN3溶液。

1.2.2.3 PYM 在通風廚中用0.06mol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液配制濃度為0.4%的PYM溶液。

1.2.2.4 秋水仙素 在通風櫥中用0.9%的NaCl溶液配制0.5%的秋水仙素溶液。

1.2.2.5 對照 蒸餾水。

1.2.3 花椒種子的處理 將3批次催芽后的種子分別在4種誘變劑溶液中浸泡8h，16h，24h，再用清水沖洗8h。

1.2.4 播種 采用育苗盤進行播種，基質選擇草炭+蛭石+珍珠巖(8∶4∶1)，澆透水后放置1d，基質濕度以手握成團，擠不出水為宜。按36個處理加3個對照組進行分區(qū)播種，播種后覆膜，保溫保濕，利于種子發(fā)芽。待幼苗長出3片真葉即可假植至試驗苗圃，株距為20cm。

1.2.5 誘變結果的統(tǒng)計分析 觀測指標為致死率，出苗時間，苗期生長勢，變異苗數(shù)量及性狀特征。

2 結果與分析

2.1 催芽時間對花椒種子誘變結果的影響

通過種子發(fā)芽情況的統(tǒng)計，種子的致死率隨著催芽時間的增加而提高，種子的萌發(fā)過程受化學誘變劑的影響，從而產生生理變化，在催芽時間為3周時致死率為60%左右，在安全范圍內。因此，選擇3周作為花椒種子化學誘變育種的催芽時間最為恰當。

表1 4種化學誘變劑對萌發(fā)種子的致死率影響

2.2 誘變處理時間對花椒種子誘變結果的影響

通過統(tǒng)計種子的出苗率對比不同誘變劑處理時間對種子的發(fā)芽率影響，4種誘變劑在16h的時候致死率均保持在50%左右，符合誘變處理的致死范圍。

表2 誘變劑處理時間對萌發(fā)種子的致死率影響

通過與未經處理的種子出苗時間對比，證實了化學誘變劑能明顯抑制花椒種子的發(fā)芽，處理時間越長，抑制作用越顯著。且PYM和秋水仙素的抑制作用大于EMS和NaN3，因此誘變劑在種子萌發(fā)過程中所發(fā)生的生理作用就越大，在能保證出苗率的情況下，可選擇PYM和秋水仙素作為合適的化學誘變劑。

表3 誘變劑處理時間種子出苗時間的影響

2.3 誘變劑種類對花椒種子誘變結果的影響

試驗測量花椒幼苗生長高度表明，EMS處理對幼苗生長有一定促進作用，平均苗高優(yōu)于其他3組和對照組；NaN3處理對幼苗生長存在抑制作用，高度均低于其他處理和對照組；PYM和秋水仙素處理苗高接近對照組。

表4 誘變劑種類對花椒幼苗高度的影響

試驗測量花椒幼苗莖粗情況表明，EMS、NaN3和PYM處理和對照組接近；秋水仙素處理對莖粗有一定影響，莖粗大于其他3組和對照組。

表5 誘變劑種類對花椒幼苗莖粗的影響

2.4 誘變劑處理產生的變異情況統(tǒng)計

2.4.1 花椒出苗子葉數(shù)量改變 花椒種子正常出苗子葉數(shù)量為2片，經過誘變劑處理的種子在出苗期發(fā)生了子葉數(shù)量變異，出現(xiàn)了3、4、7片子葉的情況(見圖1)。

圖1 花椒苗子葉變異情況

變異數(shù)量與處理時間長短、催芽時間長短、誘變劑種類均有關。處理時間越長，出現(xiàn)子葉變異數(shù)量越多，催芽時間越長，出現(xiàn)的變異數(shù)量越多，PYM和秋水仙素處理的種子變異數(shù)量較多。秋水仙素組出現(xiàn)了7片子葉的罕見情況。

圖2 變異株性狀

2.4.2 花椒苗期性狀的改變 PYM處理組出現(xiàn)了花椒植株全株性狀改變，葉片較九葉青花椒更短小，葉片油腺點減少，葉色加深，葉片氣味改變，復葉數(shù)量由9片變?yōu)?片，枝條硬度加強，對紅蜘蛛的抗性增加(圖2)。

3 結論

(1)催芽時間越長，花椒種子致死率越高，種子出苗時間越遲，種子出苗后產生的畸變越多。因此在可控的致死率范圍內，選擇催芽3周的花椒種子作為誘變處理材料最為適宜。

(2)花椒種子的致死率隨誘變劑處理時間增加而提高，在處理時間為16h時，致死率控制在60%左右，在有效的安全范圍內。

(3)4種誘變劑在誘變處理花椒種子上，PYM和秋水仙素出現(xiàn)的變異數(shù)量較其他EMS和NaN3多，因此可選擇PYM和秋水仙素作為今后的常用誘變試劑。

(4)篩選出針對花椒種子誘變育種的兩種最佳誘變方法組合為：①PYM+催芽3周+誘變16h。②秋水仙素+催芽3周+誘變16h。

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