林群英， 吳亮亮， 吳素玲， 石寶俊，2， 朱海亮， 張衛(wèi)明

(1.中華全國(guó)供銷總社南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042； 2.億利耐雀生物科技有限公司，江蘇南京 210038； 3.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210093)

通信作者：石寶俊，博士，副研究員，主要從事植物化學(xué)成分研究。E-mail：jacksonshi@126.com。

食用菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白和膳食纖維，且低脂肪，深受市場(chǎng)歡迎。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，其產(chǎn)量已經(jīng)占全球80%以上。因食用菌大部分以鮮品形式進(jìn)行流通，水分含量高，同時(shí)，工廠化生產(chǎn)具有強(qiáng)烈的地域性而農(nóng)戶生產(chǎn)則具有明顯的季節(jié)性，造成的腐爛損耗量大。目前控制食用菌采后保鮮的最有效手段是冷藏處理[1-3]和氣調(diào)措施[4]。由于冷藏保鮮需特定設(shè)備且成本高等因素，生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。為滿足食用菌保鮮的需求，開發(fā)合適的保鮮技術(shù)，是促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。保鮮劑是果蔬保鮮常用的保鮮技術(shù)，可有效抑制病原微生物，延長(zhǎng)保鮮期[5-6]。目前食用菌保鮮劑多針對(duì)生理變化和細(xì)菌性病變進(jìn)行研究，對(duì)抑制病原真菌的保鮮劑研究較少。亞硫酸鈉、殼聚糖、L-半胱氨酸及CaCl2等已被用于銀耳和金針菇保鮮研究，取得一定的效果[7-8]。本研究對(duì)60種化合物抗病原真菌活性進(jìn)行測(cè)定，利用平板試驗(yàn)測(cè)定各化合物對(duì)產(chǎn)黑曲霉、黃青霉、雜色曲霉、綠色木霉和木霉等5種病原真菌的抑制率，根據(jù)初篩選結(jié)果，分析效果較好的化合物對(duì)病原真菌的量效關(guān)系，并以金針菇為材料初步驗(yàn)證其保鮮效果，為開發(fā)食用菌保鮮劑提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

食用菌常見病原真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、雜色曲霉(A.versicolor)、綠色木霉(Trichodermaviride)、木霉(Trichodermasp.)，由中華全國(guó)供銷總社南京野生植物綜合利用研究院提供。

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉 20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，定容至1 L，121 ℃，滅菌 20 min，趁熱制成平板培養(yǎng)基。

供篩選抑菌化合物：共60種，包括：含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物(編號(hào)為ZTT，共5種)、含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號(hào)為WZF，共13種)、含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號(hào)為mrj，共18種)、含硝基咪唑及聯(lián)苯吡唑類羧酸酯結(jié)構(gòu)化合物(編號(hào)為CLW，共24種)，由南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。各化合物以無(wú)菌水配制成0.1 mg/mL濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原真菌孢子混懸液制備 各病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃下培養(yǎng)7 d。用接種針刮取病原真菌孢子或菌絲，轉(zhuǎn)至含1%吐溫80水溶液中，充分混勻，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度，將孢子濃度調(diào)整為2×106CFU/mL。

1.2.2 抗菌化合物對(duì)病原真菌的抑制率測(cè)定 將待測(cè)定的抑菌化合物劑溶液0.5 mL均勻涂布在PDA平板，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照組。經(jīng)滅菌的直徑為5 mm大小的濾紙片，加到含病原真菌孢子的混懸液內(nèi)，使其充分沾上病原菌的孢子和菌絲，于平板中央接入將帶孢子的濾紙片。20 ℃下培養(yǎng) 7 d，測(cè)定各菌落直徑大小，計(jì)算抑制率。各試驗(yàn)設(shè)置3重復(fù)。以0.1%苯甲酸鈉為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 量效關(guān)系分析 選取平板試驗(yàn)中篩選所得的對(duì)病原菌抑制效果良好的化合物配制成梯度濃度(0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL)，采取無(wú)菌水作為陰性對(duì)照組。余下操作依“1.2.2”節(jié)進(jìn)行。

1.2.4 化合物保鮮效果初步評(píng)價(jià) 選取金針菇新鮮子實(shí)體，各化合物濃度為10 mg/L，均勻噴灑至子實(shí)體表面，置于陰涼處晾干，用保鮮盒裝好，20 ℃下放置4 d，進(jìn)行水分、褐變度和可溶性還原糖測(cè)定[9]。所有試驗(yàn)于2017年1—7月在中華全國(guó)供銷總社南京野生植物綜合利用研究院進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗真菌活性篩選

2.1.1 含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物抗真菌活性 與陽(yáng)性對(duì)照苯甲酸鈉(圖1)相比，含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物(ZTT系列)中，除ZTT-2-32外，ZTT-2-31、ZTT-2-34、ZTT-2-41、ZTT-2-43均對(duì)黑曲霉有較好的抑制作用，其中ZTT-2-31和ZTT-2-43的抑制率均達(dá)19.23%(圖2)。ZTT-2-41對(duì)雜色曲霉的抑制率為 16.88%。ZTT-2-32和ZTT-2-34對(duì)綠色木霉的抑制率分別為16.83%和15.58%。此系列化合物對(duì)產(chǎn)黃青霉的抑制率均低于10%。除ZTT-2-32外，其他化合物對(duì)木霉的抑制率亦低于10%，而陽(yáng)性對(duì)照苯甲酸鈉對(duì)木霉未顯示出任何的抑制。由此可見，化合物ZTT-2-32和ZTT-2-43對(duì)5種病原真菌的抑制效果較好。

2.1.2 含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物抗真菌活性 含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物(WZF系列)中，WZF-39對(duì)黑曲霉的抑制率最高，達(dá)22.76%，其次是WZF-32，抑制率為19.51%，WZF-28、WZF-33、WZF-46和WZF-49對(duì)黑曲霉的抑制率均在10%以上(圖3)。WZF-28、WZF-34和WZF-41對(duì)產(chǎn)黃青霉的抑制率均為16.48%。對(duì)雜色曲霉的抑制率在20%以上的化合物共有11個(gè)，其中以WZF-32最高，達(dá)32%。此系列的化合物對(duì)綠色木霉和木霉的抑制率偏低，大部分均低于10%。由此可見，WZF-39對(duì)5種病原真菌的抑制效果最好，其次是WZF-32。

2.1.3 含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物抗真菌活性 含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物(mrj系列)中僅mrj-87對(duì)黑曲霉的抑制率達(dá)10%以上，其余化合物均低于10%。mrj-87對(duì)產(chǎn)黃青霉的抑制率最高，為21.5%，其次是mrj-80和mrj-90。mrj-67 對(duì)雜色曲霉的抑制率最高，為21.89%，mrj-49和mrj-54對(duì)綠色木霉的抑制率均在20%以上，而mrj-70、mrj-86 和mrj-90對(duì)木霉的抑制率在20%以上，其中 mrj-90 的抑制率高達(dá)28.16%(圖4)。結(jié)合對(duì)5種病原真菌的抑制率，mrj-70對(duì)單一病原真菌的抑制雖不突出，但其對(duì)5種病原真菌的抑制卻最為全面。由此可推斷，mrj-70和mrj-87是此系列抗真菌活性較好的化合物。

2.1.4 含硝基咪唑及聯(lián)苯吡唑類羧酸酯化合物抗真菌活性 含硝基咪唑及聯(lián)苯吡唑類羧酸酯化合物(CLW系列)對(duì)5種病原真菌的抑制效果較其他系列差，對(duì)黑曲霉的抑制率最高的是CLW-143，僅為11%(圖5)。CLW-115對(duì)產(chǎn)黃青霉的抑制率最高，為16.24%，其次為CLW-120，抑制率為 14.79%，大部分化合物的抑制率在10%以下。CLW-140對(duì)雜色曲霉的抑制率為18.91%，大部分化合物的抑制率在10%以下。CLW-137對(duì)綠色木霉的抑制率最高，達(dá)24.4%，其次是CLW-115，為22.04%。另有12個(gè)化合物的抑制率在10%以上，其他的則低于10%。此系列化合物對(duì)木霉的抑制率不高，CLW-120為最高，抑制率為15.01%。

2.2 量效關(guān)系分析

化合物ZTT-2-32和ZTT-2-43對(duì)黑曲霉的抑制效果存在明顯的量效關(guān)系，隨著濃度的增大，抑菌率亦隨之提高(圖6)。化合物WZF-39和mrj87對(duì)產(chǎn)黃青霉抑制效果同樣存在明顯的量效關(guān)系(圖7)。這4種化合物的結(jié)構(gòu)式見圖8。

2.3 化合物保鮮效果的初步評(píng)價(jià)

化合物WZF-39對(duì)金針菇的失質(zhì)量率和褐變度有明顯的抑制作用，失質(zhì)量率和褐變率分別為4.73%和0.18(圖9)。其次是ZTT-2-43和mrj-87，金針菇的失質(zhì)量率和褐變度分別為5.07%、0.22和4.87%、0.25，明顯低于空白對(duì)照組。這說(shuō)明化合物對(duì)金針菇具有一定的保鮮效果。

3 討論

通過(guò)對(duì)60種化合物對(duì)食用菌病原菌抑制率的測(cè)定、量效關(guān)系分析以及初步的保鮮效果評(píng)價(jià)，獲得4種抗病原真菌效果較好的化合物，分別是含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物2種(編號(hào)：ZTT-2-32和ZTT-2-43)、含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號(hào)：WZF-39)、含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號(hào)：mrj-87)。吡唑酰胺類化合物具有殺蟲和抗菌等多種生物活性等方面有報(bào)道[10-11]，本研究篩選獲得的 WZF-39 和mrj-87這2種化合物的抗真菌活性與前人報(bào)道相似。食用菌采后存貯和流通過(guò)程中，病原真菌是導(dǎo)致腐爛的重要生物因素，而這些病原真菌可能源于生產(chǎn)過(guò)程[12-13]，本研究針對(duì)病原真菌進(jìn)行保鮮劑篩選開發(fā)，并獲得4種抑制率較好的化合物，為開發(fā)食用菌專用型保鮮劑提供了良好的原料。這些化合物以天然化合物為基礎(chǔ)，進(jìn)行一定的結(jié)構(gòu)修飾而成。這種方法解決了天然產(chǎn)物的提取工藝復(fù)雜，成本高，而且資源消耗非常大的問(wèn)題[14]，為篩選出高效的綠色防腐保鮮劑提供了快捷有效的途徑，為實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的技術(shù)支撐。

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