付瑞敏， ?；燮?， 邢文會(huì)， 陳五嶺

(1.河南教育學(xué)院生命科學(xué)系，河南鄭州 450046； 2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

通信作者：陳五嶺，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)業(yè)、環(huán)境及食品微生物研究。E-mail：angelaminmin@163.com。

蘋果青霉病是蘋果采后最為常發(fā)的病害，其致病菌是擴(kuò)展青霉菌(Penicilliumexpansum)[1]。由于在果實(shí)的貯藏時(shí)期或運(yùn)輸途中，不可避免會(huì)造成果實(shí)相互之間的碰撞而導(dǎo)致機(jī)械損傷，此時(shí)原本潛伏于果實(shí)表面的擴(kuò)展青霉菌孢子會(huì)從傷口入侵果實(shí)，產(chǎn)生菌絲體，不僅會(huì)引起果實(shí)腐爛，其次級(jí)代謝產(chǎn)物展青霉素還會(huì)危害人體健康，造成極為嚴(yán)重的食品安全問題[2]。通常采用噴灑克霉凈、氟硅唑等化學(xué)殺菌劑防治蘋果采后青霉病，這種方法具有見效快、效果好等優(yōu)點(diǎn)，但長期使用易使病菌產(chǎn)生抗藥性，并危害食品安全，污染環(huán)境。隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，越來越多的生物農(nóng)藥被用于植物病害的防治中[3-4]。其中，芽孢桿菌以其對(duì)環(huán)境的高度耐受性和產(chǎn)生各種多肽類、脂肽類和細(xì)菌素等抑菌性物質(zhì)的特點(diǎn)，成為當(dāng)前生物農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)。解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗生素，其中，通過非核糖體多肽合成酶合成的分子量小于2 000 u的脂肽類抗生素發(fā)揮重要的抗菌作用。根據(jù)其氨基酸構(gòu)型不同，將解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)的脂肽抗生素分為表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、豐原素(fengycin)等3個(gè)家族。豐原素、伊枯草菌素具有極強(qiáng)的抗真菌活性，特別是豐原素，可以顯著抑制絲狀真菌的生長。表面活性素具有很強(qiáng)的表面活性，其乳化和發(fā)泡能力都很強(qiáng)，可以有效降低液體表面的張力。此外，表面活性素還有溶血、抗病毒、抗細(xì)菌等生物學(xué)活性[5-7]。由于具有重要的生物活性，很多脂肽已從芽孢桿菌的菌株中得以分離和鑒定，并從遺傳水平闡明了其生物功能。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-16-8是筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期分離選育的，可以有效抑制擴(kuò)展青霉的拮抗菌[8]。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，簡稱MALDI-TOF-MS)分析該菌的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)該菌株可以產(chǎn)豐原素、表面活性素等2類脂肽抗生素。通過檢測這2種物質(zhì)拮抗擴(kuò)展青霉菌的性能，發(fā)現(xiàn)豐原素是解淀粉芽孢桿菌BA-16-8抑制擴(kuò)展青霉菌的主要物質(zhì)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，本研究采用分子遺傳學(xué)技術(shù)，通過構(gòu)建解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的豐原素缺失突變體并結(jié)合抑菌試驗(yàn)和果實(shí)生防試驗(yàn)，以證實(shí)豐原素在解淀粉芽孢桿菌抑制擴(kuò)展青霉菌中所起的作用，從而為探討解淀粉芽孢桿菌的抑菌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 試驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒的詳細(xì)信息如表1所示。

1.1.2 主要試劑 試驗(yàn)所用試劑的詳細(xì)信息如表2所示。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 Agilnt 1100series高效液相色譜系統(tǒng)，購自美國安捷倫公司；液相色譜-電噴霧質(zhì)譜儀由Waters Alliance2690高效液相色譜儀(購自美國Waters公司)和TSQ Quantum Discovery三級(jí)四極桿質(zhì)譜儀(購自美國Thermo Fisher Scientific公司)組成。

表1 試驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒

表2 主要試劑及廠家

1.1.4 引物 本試驗(yàn)所用來擴(kuò)增解淀粉芽孢桿菌的fenC基因(7 647 bp)上下游臂的引物根據(jù)NCBI上的解淀粉芽孢桿菌Q426菌株基因組序列設(shè)計(jì)，抗性基因spc的引物根據(jù)質(zhì)粒PUS19設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)工作由Primer premier 5.0軟件完成，具體信息如表3所示，引物合成及序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表3 試驗(yàn)所用引物的信息

注：引物序列下劃線是限制性酶切位點(diǎn)，用于基因連接。

1.1.5 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(BEP)的具體配方參照文獻(xiàn)[9]，BEPA為固體培養(yǎng)基，BEPB為液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基主要用于拮抗菌的培養(yǎng)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)及馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)的具體配方參照文獻(xiàn)[9]，該培養(yǎng)基主要用于病原菌的培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌豐原素基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)解淀粉芽孢桿菌Q426全基因組序列(JQ271536)，找到豐原素基因fenC及其編碼的蛋白序列，采用Blast在線軟件對(duì)編碼蛋白豐原素合成酶C的同源性及蛋白功能域進(jìn)行分析。

1.2.2 穿梭質(zhì)粒pMAD構(gòu)建缺失突變株BA-16-8Δfen

1.2.2.1 突變載體的構(gòu)建 采用基因組DNA提取試劑盒提取解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的基因組DNA，以其為模板以P1、P2為引物擴(kuò)增fenC上游片段。擴(kuò)增片段長度約為 1 844 bp，將其作為上游同源臂；以P3、P4為引物擴(kuò)增下游片段，擴(kuò)增長度約為1 645 bp，將其作為下游同源臂。參照文獻(xiàn)[10-12]，以質(zhì)粒PUS19序列為模板，設(shè)計(jì)壯觀霉素抗性基因的引物P5、P6，并擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因spc，擴(kuò)增長度約為 1 146 bp，將PCR擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后用瓊脂糖凝膠電泳回收，連入pMAD質(zhì)粒的相關(guān)限制性酶切位點(diǎn)，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)DH5α，經(jīng)篩選最終獲得pMAD-ΔfenC，將其進(jìn)行測序分析，并驗(yàn)證所構(gòu)建突變體序列的正確性，同源重組過程如圖1所示。

1.2.2.2 突變子的篩選 所得pMAD-ΔfenC突變子經(jīng)測序驗(yàn)證其正確性后，參照Arnuad的方法[12]，采用電轉(zhuǎn)化法(條件為電壓2 kV，電容25 μF，電阻100 Ω)將其轉(zhuǎn)入解淀粉芽孢桿菌BA-16-8中，并篩選fenC基因缺失突變體。pMAD是溫度敏感型穿梭質(zhì)粒，可同時(shí)在大腸桿菌和芽孢桿菌中復(fù)制，該質(zhì)粒中含有用來編碼β-半乳糖苷酶的LacZ基因，它可以分解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)產(chǎn)生藍(lán)色菌落。此外，質(zhì)粒中存在溫度敏感復(fù)制子，當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)，該質(zhì)粒可以穩(wěn)定存在于革蘭氏陽性菌的細(xì)胞中，質(zhì)粒上所攜帶的基因可以通過菌株染色體上的同源序列進(jìn)行交換甚至雙交換；而當(dāng)溫度升高至40 ℃及以上時(shí)，該質(zhì)粒就容易丟失，因此，陽性突變子的篩選先經(jīng)過30 ℃的基因交換，再經(jīng)過40 ℃的質(zhì)粒丟失。

當(dāng)基因敲除突載體pMAD-Δfen轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α后，將其涂布于含有100 μg/mL X-gal的BEP平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，此時(shí)pMAD-Δfen或是游離在細(xì)胞中或是發(fā)生了單交換，感受態(tài)細(xì)胞可以表達(dá)LacZ基因，因此平板上長出的藍(lán)色菌落就是轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子。

將選出的藍(lán)色菌落轉(zhuǎn)接入解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的液體培養(yǎng)基中，42 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的含50 μg/mL壯觀霉素的BEP液體培養(yǎng)基中，42 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h；將溫度降至30 ℃，180 r/min繼續(xù)搖床振蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接至含有100 μg/mL X-gal和50 μg/mL壯觀霉素的BEP平板中，30 ℃ 培養(yǎng)24 h，選取白色菌落分別接于含3 μg/mL紅霉素的BEP平板上，挑選紅霉素敏感菌株，即為構(gòu)建的fenC基因缺失突變的突變菌株，為BA-16-8Δfen菌株。

1.2.2.3 突變子的鑒定 以BA-16-8Δfen菌株為模板，分別以P1/P4、P7/P8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以BA-16-8菌株為陰性對(duì)照，把所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，比對(duì)目的條帶的大小是否與預(yù)測的大小一致，若一致，則說明spc基因成功替代了fenC基因，即構(gòu)建突變子成功，反之，則不成功。最后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收并進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen的HPLC分析

1.2.3.1 菌株代謝產(chǎn)物脂肽粗提液的制備 將培養(yǎng)24 h的野生菌株和突變菌株的菌體發(fā)酵液于常溫下8 000 r/min離心 20 min，棄沉淀，將所得上清液置于無菌錐形瓶中，用 7 mol/L HCl溶液將其pH值調(diào)為2.0，無菌條件下分裝至 10 mL 的無菌離心管中(每管10 mL)，4 ℃過夜，10 000 r/min離心20 min，取沉淀，在沉淀中加入0.5 mL中性甲醇溶液，以此方法操作2次，將所得萃取液合并，并將其濃縮至5倍濃度，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后即為菌株代謝產(chǎn)物的脂肽粗提液。

1.2.3.2 HPLC分離純化脂肽類抗生素 本試驗(yàn)檢測波長為280 nm，柱子溫度為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，等梯度洗脫進(jìn)行樣品分析，洗脫條件如表4所示，手動(dòng)收集各組分，將收集液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮待用。

表4 高效液相色譜洗脫條件

1.2.3.3 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen對(duì)擴(kuò)展青霉菌抑制活性的檢測 取野生菌株和突變菌株經(jīng)HPLC分離純化的濃縮液各200 μL，采用牛津杯法檢測野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen的脂肽拮抗擴(kuò)展青霉菌的能力，培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為5 d，測量并記錄牛津杯周圍出現(xiàn)的抑菌圈直徑，以無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen對(duì)蘋果青霉病的防效測定

1.2.4.1 擴(kuò)展青霉菌孢子液的制備 參照文獻(xiàn)[13]，制備擴(kuò)展青霉菌孢子液。

1.2.4.2 防效測定 采用果實(shí)生防試驗(yàn)[14-15]，對(duì)野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen防治蘋果青霉病的效果進(jìn)行測定。試驗(yàn)樣本為100個(gè)紅富士蘋果，所選蘋果大小及成熟度均一致。將蘋果經(jīng)75%乙醇消毒并經(jīng)清水洗凈后，用無菌打孔器在每個(gè)蘋果表面打孔，孔徑6 mm，孔深5 mm。試驗(yàn)共分為5組：處理1為10 μL野生菌株BA-16-8菌懸液+10 μL 擴(kuò)展青霉菌孢子液，處理2為10 μL 野生菌株BA-16-8脂肽粗提液+10 μL 擴(kuò)展青霉菌孢子液，處理3為10 μL 突變菌株BA-16-8Δfen菌懸液+10 μL 擴(kuò)展青霉菌孢子液，處理4為10 μL 突變菌株BA-16-8Δfen脂肽粗提液+10 μL 擴(kuò)展青霉菌孢子液，處理5(對(duì)照)為10 μL無菌水+10 μL擴(kuò)展青霉菌孢子液。將各組處理液分別加于蘋果的孔洞中，每個(gè)處理重復(fù)20次。將處理后的蘋果分別裝入培養(yǎng)箱中，溫度為28 ℃，濕度為95%，96 h后觀察蘋果的染病情況，并統(tǒng)計(jì)菌絲生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌的豐原素合成酶生物信息學(xué)分析

通過對(duì)解淀粉芽孢桿菌Q426菌株全基因組序列(JQ271536)分析，發(fā)現(xiàn)Q426的豐原素合成酶基因簇序列與解淀粉芽孢桿菌DSM7菌株(FN597644)的豐原素合成酶基因序列的同源性高達(dá)96%，與解淀粉芽孢桿菌Y2菌株(NC17912)的同源性達(dá)93%，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)168的豐原素合成酶操縱子(AL009126)序列的同源性為88%。豐原素操縱子包含5個(gè)開放閱讀框，它們分別是fenC、fenD、fenE、fenA、fenB，這5個(gè)操縱子分別編碼合成酶的5個(gè)單體酶，即FenC、FenD、FenE、FenA、FenB[16]。

2.2 解淀粉芽孢桿菌BA-16-8 fenC基因缺失突變子的構(gòu)建篩選

2.2.1fenC基因缺失突變載體pMAD-Δfen的構(gòu)建 根據(jù)NCBI上已知菌株解淀粉芽孢桿菌Q426的第1個(gè)豐原素合成酶操縱子fenC基因的上下游序列，設(shè)計(jì)出4條引物，并以解淀粉芽孢桿菌BA-16-8菌株的基因組為模板，對(duì)fenC的上游序列(上游臂)和下游序列(下游臂)進(jìn)行擴(kuò)增。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增分別獲得長度約為1 844 bp的上游序列、1 645 bp 的下游序列。為構(gòu)建缺失突變載體，選用壯觀霉素抗性基因spc取代fenC基因，通過設(shè)計(jì)spc基因的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條大小為1 146 bp的條帶，將PCR擴(kuò)增得到的這3個(gè)條帶分別用限制性內(nèi)切酶酶切，并用連接酶逐一按上游臂、spc、下游臂的順序連接至pMAD載體上，構(gòu)建fenC基因缺失突變載體pMAD-Δfen。分別以pMAD-Δfen、pMAD為模板，以P1/P2、P3/P4、P5/P6為引物對(duì)載體進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，以pMAD-Δfen為模板的PCR產(chǎn)物中有上游臂、下游臂和spc抗性基因，而以pMAD為模板的PCR產(chǎn)物中沒有，說明構(gòu)建載體成功。

2.2.2 菌株BA-16-8的fenC基因缺失突變體BA-16-8-Δfen的構(gòu)建與鑒定 參照Arnuad的方法[12]，采用電轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入解淀粉芽孢桿菌BA-16-8中，經(jīng)過抗生素篩選和藍(lán)白斑篩選，挑選陽性菌株，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切鑒定，經(jīng)30 ℃雙交換及高溫質(zhì)粒丟失，最終篩選出fenC基因缺失突變體。為鑒定突變子的構(gòu)建是否成功，以BA-16-8Δfen菌株為模板，以P1/P4、P7/P8為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以BA-16-8菌株為陰性對(duì)照，所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖2可知，采用引物P1/P4，在BA-16-8菌株上得到大小約為11 kb(up-fenC-down)的片段，在BA-16-8ΔfenC菌株上得到大小約為4.6 kb(up-spc-down)的片段；采用引物P7/P8，在BA-16-8菌株上得到大小約為 7.6 kb(fenC)的片段，在BA-16-8Δfen菌株上沒有擴(kuò)增出片段。上述結(jié)果初步表明，突變菌株BA-16-8Δfen的fenC基因已經(jīng)被敲除，將PCR產(chǎn)物純化并測序， 所得結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)

了BA-16-8菌株中的fenC基因已經(jīng)被spc基因所替代。

2.3 解淀粉芽孢桿菌BA-16-8野生型及突變子的HPLC分析結(jié)果

對(duì)野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen的粗提液進(jìn)行HPLC分離純化。由圖3可知，野生菌株BA-16-8主要分離出2組物質(zhì)，a物質(zhì)的保留時(shí)間為 21.360 min，b物質(zhì)的保留時(shí)間為41.260 min；突變菌株BA-16-8Δfen主要分離出1組物質(zhì)，其保留時(shí)間為21.370 min。對(duì)照同一洗脫條件下的表面活性素、豐原素標(biāo)樣，推測野生菌株BA-16-8中分離出的物質(zhì)為表面活性素、豐原素，突變菌株BA-16-8Δfen中分離出的物質(zhì)為豐原素。

將HPLC分離純化出的物質(zhì)分別經(jīng)收集、濃縮并定容至1 mL，用牛津杯法檢測各片段的抑菌活性。由表5可知，只有b物質(zhì)有明顯的拮抗活性。與野生株相比，失去了豐原素合成能力的突變株抑制擴(kuò)展青霉菌的能力顯著下降，它的無細(xì)胞發(fā)酵液幾乎喪失了抑菌性能。

表5 野生菌株及突變子的脂肽蛋白抗擴(kuò)展青霉菌效果

2.4 解淀粉芽孢桿菌BA-16-8野生型及突變子脂肽類產(chǎn)物質(zhì)譜分析結(jié)果

BA-16-8經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測分析，獲得了粗提液中各脂肽的相對(duì)分子質(zhì)量，所得質(zhì)譜圖如圖4所示，所得分析結(jié)果如表6所示。圖4-a中有2個(gè)系列的離子峰，結(jié)合表6中的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+離子分析結(jié)果，可知它們分別為表面活性素、豐原素家族的同系物。圖4-b中只有1個(gè)系列的離子峰，結(jié)合表6中的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+離子分析結(jié)果，可知它們是表面活性素家族的同系物。將質(zhì)譜分析結(jié)果、PCR檢測結(jié)果和HPLC結(jié)果結(jié)合起來可知，野生菌株BA-16-8的發(fā)酵液中提取的抗菌性脂肽為豐原素、表面活性素，而突變子BA-16-8Δfen的發(fā)酵液中提取的抗菌性脂肽為表面活性素，這說明突變子沒有產(chǎn)生豐原素，說明fenC基因缺失突變子構(gòu)建成功。綜合HPLC、MS和抑菌性能分析結(jié)果，可以確定豐原素在BA-16-8菌株抑制擴(kuò)展青霉菌的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

2.5 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen對(duì)蘋果青霉病的防效測定

由表7可知，96 h后，野生菌株BA-16-8的菌懸液及無細(xì)胞發(fā)酵液均可以對(duì)擴(kuò)展青霉菌在蘋果表面的生長產(chǎn)生較

表6 野生菌株及突變子的質(zhì)譜分析結(jié)果

強(qiáng)的抑制作用。然而被敲除了fenC基因的突變菌株 BA-16-8Δfen的防治效果明顯低于野生菌株，特別是突變菌株BA-16-8Δfen的無細(xì)胞發(fā)酵液處理組，其病斑直徑幾乎和對(duì)照一致，這表明野生菌株BA-16-8的菌株細(xì)胞和脂肽提取物可以較好地防治蘋果采后青霉病，而突變子BA-16-8Δfen在喪失了豐原素合成能力之后，對(duì)青霉病的防治能力也顯著降低，該結(jié)論再次表明了解淀粉芽孢桿菌 BA-16-8 拮抗擴(kuò)展青霉菌病原菌及防治青霉病的主要物質(zhì)是豐原素。

表7 不同處理對(duì)蘋果青霉病的抑制效果

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌屬是重要的生防菌，其模式菌株是枯草芽孢桿菌，而解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系極為接近，同枯草芽孢桿菌一樣，它也可以表達(dá)多種抗菌性多肽，包括核糖體合成途徑合成肽和非核糖體合成途徑合成肽[17]。這些多肽或是協(xié)同或是獨(dú)立發(fā)揮著抑制病原菌的作用。

針對(duì)蘋果采摘后青霉病的生物防治，筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期選育出1株可以高效抑制青霉病致病菌擴(kuò)展青霉菌的解淀粉芽孢桿菌BA-16-8，通過分離純化該菌株的抑菌活性物質(zhì)并對(duì)比其抑菌活性，了解到豐原素對(duì)擴(kuò)展青霉菌的抑制效果顯著高于表面活性素，因此，推測豐原素可能是解淀粉芽孢桿菌抑制擴(kuò)展青霉菌的主要物質(zhì)。為證實(shí)該推測，本研究以菌株BA-16-8為試驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)同源重組原理，借助溫度敏感型質(zhì)粒pMAD構(gòu)建了1個(gè)豐原素合成酶基因功能缺陷突變菌株BA-16-8Δfen，經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳分析及序列測定，最終確定fenC基因被成功敲除。通過檢測突變菌株和野生菌株所產(chǎn)脂肽蛋白體內(nèi)和體外的抑菌活性，結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌的突變子BA-16-8Δfen不僅喪失了合成豐原素的能力，也失去了抑制擴(kuò)展青霉菌和防治蘋果青霉病的能力，因此確定抑制擴(kuò)展青霉菌的主要物質(zhì)是豐原素。

報(bào)道顯示，豐原素可以抑制多種植物病原菌特別是絲狀真菌[18]，但其具體作用機(jī)制仍是眾說紛紜。Tanaka等的研究表明，豐原素可以破壞細(xì)菌胞膜的結(jié)構(gòu)及滲透性，豐原素可以通過破壞病原真菌細(xì)胞壁的類脂層，從而使其細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞[19]。Tao等的研究表明，豐原素可以作用于病原真菌的胞內(nèi)物質(zhì)，如核酸等[20]。這些說法尚有待于進(jìn)一步考察、確定。

據(jù)報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌的基因組中有大量成簇的基因用于編碼抗菌肽等抑菌物質(zhì)，包括細(xì)菌素和脂肽類抗生素等[21]。但是，這并不代表同一種菌在生長代謝過程中就可以同時(shí)產(chǎn)生所有抑菌物質(zhì)，某些用來編碼或啟動(dòng)抗生素合成的基因必須在某種特定的條件或階段才會(huì)正常表達(dá)[22]。解淀粉芽孢桿菌基因組中就存在多種編碼脂肽抗生素的基因簇，如編碼表面活性素的sfp、編碼伊枯草菌素的itu、編碼豐原素的fen等。

通過檢測解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的脂肽抗菌性，結(jié)果顯示，豐原素對(duì)擴(kuò)展青霉菌有明顯的抑制效果，然而由于菌株細(xì)胞本身也具有抑菌性，因此，單純通過HPLC分離純化的片段很難明確豐原素在解淀粉芽孢桿菌抑制擴(kuò)展青霉菌的過程中發(fā)揮的作用。因此，采用分子遺傳學(xué)手段，構(gòu)建豐原素表達(dá)缺失突變菌株，通過對(duì)比野生型和突變型的抗菌性能及防治青霉病的效果，最終確定解淀粉芽孢桿菌BA-16-8在抑制擴(kuò)展青霉菌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的物質(zhì)是豐原素。除了擴(kuò)展青霉菌感染所致的蘋果青霉病，豐原素也是抑制桃褐腐病和番茄枯萎病的主要物質(zhì)。豐原素究竟是如何發(fā)揮其抑菌作用的？這種抑菌作用有沒有作用對(duì)象的特異性？在確定了豐原素防治擴(kuò)展青霉菌所致的青霉病中的主導(dǎo)地位之后，接下來將就豐原素對(duì)擴(kuò)展青霉菌的抑菌機(jī)制展開研究，以期為抗生素脂肽的開發(fā)及利用提供理論依據(jù)。

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