劉玉玲 ，鐵柏清 *，李園星露 ，魏祥東 ，彭 鷗 ，葉長(zhǎng)城 ，劉孝利 ，孫 健

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省重金屬污染耕地安全高效利用工程研究中心，長(zhǎng)沙 410013；3.廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

重金屬鎘（Cd）因移動(dòng)性大、毒性高、污染面積較廣被稱為“五毒之首”[1]。21世紀(jì)以來(lái)，隨著工業(yè)飛速發(fā)展，礦產(chǎn)累年采冶，導(dǎo)致農(nóng)田Cd污染日趨嚴(yán)重[2]。我國(guó)受Cd污染地區(qū)已涉及11個(gè)?。ㄊ校┑?5個(gè)地區(qū)[3]。目前對(duì)受重金屬污染的土壤修復(fù)，主要采用的技術(shù)方法有化學(xué)修復(fù)、物理修復(fù)、生物修復(fù)和微生物修復(fù)[4]。微生物作為土壤中的活性膠體，具有比表面積大、帶電荷、代謝活動(dòng)旺盛、種類繁多、數(shù)量大等特點(diǎn)，有的土壤微生物不僅參與土壤中污染物的循環(huán)過(guò)程，還可作為環(huán)境載體吸附重金屬污染物[5]。由于微生物對(duì)重金屬具有積累、吸附和解毒作用，土壤重金屬污染微生物處理技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。Francesca等[6]研究發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌對(duì)Cd的生物吸附去除率達(dá)到77%。晉銀佳等[7]證實(shí)熒光假單胞菌菌體代謝能夠產(chǎn)生鐵載體，鐵載體能夠與Cd2+絡(luò)合，使得油麥菜對(duì)Cd的吸收減少，其中采用砂基方式培養(yǎng)的油麥菜Cd含量降幅最高達(dá)50.74%。

Delftia菌屬是1999年由Wen等[8]發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新菌屬，目前對(duì)該類菌的研究主要集中于對(duì)有機(jī)污染物的去除能力上，如 Zhang 等[9]、梁泉峰[10]、Xiao 等[11]研究發(fā)現(xiàn)Delftia能夠高效降解苯胺并分析了其降解的相關(guān)基因和降解途徑。González等[12]發(fā)現(xiàn) Delftia sp.能降解 2，4－D，在 2，4－D 初始濃度為 100 mg·L－1時(shí)，降解率達(dá)到99.9%。葉杰旭等[13]發(fā)現(xiàn)Delftia能以氯苯為唯一碳源和能源，并且能夠降解氯苯。對(duì)于Delftia修復(fù)重金屬污染土壤的研究較少，Prakash等[14]報(bào)道了D.tsuruhatensisAR－7可以通過(guò)胞內(nèi)積累或細(xì)胞膜吸附將 Se4+轉(zhuǎn)化為 Se0，Caravaglia 等[15]、Morel等[16]和Ubalde等[17]報(bào)道了Cr（Ⅵ）抗性菌 D.acidovorans AR 和 Delftia sp.JD2對(duì)Cr（Ⅵ）的生物轉(zhuǎn)化，其可將Cr（Ⅵ）還原成毒性較低的Cr（Ⅲ）。目前還沒(méi)有Delftia對(duì)于Cd污染土壤修復(fù)方面的報(bào)道。

土壤中重金屬以各種不同的形態(tài)存在，重金屬的不同形態(tài)具有不同的化學(xué)活性和生物有效性，重金屬形態(tài)分布在一定程度上可以反映重金屬的生物有效性和毒性變化，重金屬的形態(tài)及其轉(zhuǎn)化對(duì)研究重金屬的環(huán)境效益及重金屬污染治理修復(fù)具有重要意義[18－19]。目前，關(guān)于微生物－土壤重金屬形態(tài)的研究較少，本研究通過(guò)從礦區(qū)鎘污染土壤中篩選分離的耐Cd細(xì)菌，探究目標(biāo)菌株對(duì)土壤中Cd形態(tài)分布的影響，以期為重金屬污染土壤微生物修復(fù)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

表1 土壤理化性質(zhì)Table1 Soil physical and chemical properties

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采自湖南省株洲市霞灣地區(qū)某冶煉廠周邊受重金屬污染的0～20 cm土層土壤，為偏中性紫砂土。由表1可知，重金屬含量普遍較高，與國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（為保障農(nóng)林生產(chǎn)和植物正常生長(zhǎng)的土壤臨界值）相比，Pb、Zn、Cu、Cd的含量分別為國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的 2.71、10.06、15.61、174.87倍，其中Cd超標(biāo)最為嚴(yán)重。

1.2 耐Cd菌株的篩選

培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15～20 g、蒸餾水 1 L，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓滅菌鍋滅菌30 min。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

稱取5 g土樣，加入到45 mL已滅菌并裝有玻璃珠的液體培養(yǎng)基（Cd2+含量 50 mg·L－1）中，30 ℃、150 r·min－1振蕩培養(yǎng)，4 d為一個(gè)周期，一個(gè)周期結(jié)束后以10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的液體培養(yǎng)基（Cd2+含量 100 mg·L－1）中，150 r·min－1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)一個(gè)周期，再轉(zhuǎn)接4次，至液體培養(yǎng)基中的Cd2+濃度增加到300 mg·L－1。取最后一次富集培養(yǎng)液 0.2 mL，以 10 倍比稀釋法稀釋后涂布于分離純化培養(yǎng)基平板上，并在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48～96 h。肉眼觀察菌落生長(zhǎng)情況，并分別挑選不同形態(tài)的典型單菌落，在新的分離純化培養(yǎng)基平板上繼續(xù)劃線分離，直到培養(yǎng)出菌落特征一致的純菌種。然后將純菌種接種到含Cd2+的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，觀察菌株生長(zhǎng)情況，選擇生長(zhǎng)較好的菌株保存并進(jìn)行吸附試驗(yàn)。取1 mL菌液接入50 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含Cd2+濃度為 10 mg·L－1和 100 mg·L－1，在 30 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h后，取25 mL培養(yǎng)液于13 000 r·min－1離心15 min，取上清液測(cè)定Cd2+濃度，并篩選Cd2+吸附率最高的菌株，即為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 目標(biāo)菌株鑒定

菌株的形態(tài)及生理生化鑒定：觀察菌株的形態(tài)特征并根據(jù)菌株的形態(tài)特征，按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

菌株16S rRNA的擴(kuò)增和鑒定：將1.2中篩選出的目標(biāo)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取適量的菌體到30 μL無(wú)菌水中，98 ℃熱解 20 min 后，4000 r·min－1離心 1 min。取1 μL上清液作為模板DNA，用于PCR擴(kuò)增。用細(xì)菌 16S rRNA 通用引物（27F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′和 1492R：5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′）來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 目標(biāo)菌株的生長(zhǎng)曲線

將目標(biāo)菌株接種在液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r·min－1培養(yǎng)24 h，以2%的接種量接入新的Cd2+濃度為0（CK）、10、100 mg·L－1培養(yǎng)基中，在 0～54 h 周期里，以3 h為時(shí)間間隔取樣，于600 nm下測(cè)定不同濃度下的生長(zhǎng)曲線。

1.5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株去除Cd2+效果的影響

1.5.1 菌體的制備

將目標(biāo)菌株接種在液體培養(yǎng)基中30℃、120 r·min－1培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水洗滌兩次后制成OD600=1.6（7.6×108cfu·mL－1）的菌懸液。

1.5.2 pH對(duì)目標(biāo)菌株吸附Cd2+的影響

將50 mL含10 mg·L－1Cd2+的培養(yǎng)液pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每個(gè) pH 值設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，滅菌后對(duì)培養(yǎng)液的pH進(jìn)行測(cè)定，并做相應(yīng)校正。按2%接種量分別接入菌懸液，30 ℃、120 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h，13 000 r·min－1離心 5 min，采用 ICP－OES 測(cè)定上清液Cd2+的濃度，計(jì)算目標(biāo)菌株對(duì)Cd2+的吸附量和吸附率。

1.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)目標(biāo)菌株吸附Cd2+的影響

將 50 mL含 10 mg·L－1Cd2+的培養(yǎng)液 pH 調(diào)為7.0，滅菌后按2%的接種量接入菌懸液，分別于10、20、30、35、40 ℃下 120 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h，測(cè)定方法同1.5.2。

1.5.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)目標(biāo)菌株吸附Cd2+的影響

將 50 mL含 10 mg·L－1Cd2+的培養(yǎng)液 pH 調(diào)為7.0，滅菌后按2%的接種量接入菌懸液，于30℃、120 r·min－1分別振蕩培養(yǎng) 18、24、36、48、72 h，測(cè)定方法同1.5.2。

1.5.5 Cd2+濃度對(duì)目標(biāo)菌株吸附Cd2+的影響

分別配制 Cd2+濃度為 1、5、10、50、100 mg·L－1的培養(yǎng)液，pH調(diào)為7.0，滅菌后按2%的接種量接入菌懸液，于 30 ℃、120 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h，測(cè)定方法同1.5.2。

1.6 菌株對(duì)土壤Cd形態(tài)的影響

試驗(yàn)用土先經(jīng)過(guò)陽(yáng)光曝曬后過(guò)2 mm篩，試驗(yàn)用塑料小盆缽的上緣直徑10 cm，底面直徑9 cm，高14 cm。每盆裝土150 g（以風(fēng)干土計(jì)）。將菌株培養(yǎng)48 h后接種 3 mL（T1，接種量為 1.44×1011cfus）和 10 mL（T2，接種量為 4.8×1011cfus）到土壤中，加蒸餾水使土壤含水量保持田間持水量的60%。以不加菌的為對(duì)照（CK），分別于接種后 0、5、10、20、30 d 取鮮土樣 10 g測(cè)定土壤Cd的形態(tài)。

1.7 分析方法

Cd的形態(tài)分析采用BCR法[20]，用ICP－OES（美國(guó)PE8300）測(cè)定其Cd的濃度。BCR提取法：（1）用40 mL 0.11 mol·L－1的醋酸（HOAc）在室溫（22±5）℃下提取弱酸可溶態(tài) Cd；（2）用 40 mL 0.5 mol·L－1鹽酸羥胺（pH=2.0）在室溫（22±5）℃下提取可還原態(tài) Cd；（3）加入 10 mL 8.8 mol·L－1H2O2（pH=2～3）溶液，先在室溫（22±5）℃下反應(yīng) 1 h，間歇振蕩，然后在（85±2）°C 水浴反應(yīng)1 h，取下蓋子繼續(xù)水浴加熱使其體積至3 mL；再向其中加入10 mL 8.8 mol·L－1H2O2（pH=2～3）溶液，85±2°C水浴反應(yīng)1 h，繼續(xù)水浴加熱使其體積小于1 mL。冷卻后加入50 mL 1 mol·L－1NH4OAc提取可氧化態(tài)Cd；（4）殘?jiān)鼞B(tài)Cd提取采用全消解處理，消解步驟同土壤全量消解。

1.8 數(shù)據(jù)處理

圖表處理運(yùn)用Microsoft Excel軟件；多重差異顯著性分析運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22.0軟件。計(jì)算公式：吸附率=（初始濃度－終濃度）/初始濃度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐Cd菌株的分離與鑒定

供試土壤樣品經(jīng)梯度富集培養(yǎng)后，分離純化得到生長(zhǎng)良好的耐Cd菌株12株，其中細(xì)菌9株，真菌3株，分別命名為 B1～B9 和 F1～F3（表 2）。從表 2 可以看出，當(dāng)液體培養(yǎng)基中Cd2+初始濃度為10 mg·L－1時(shí)，B9的吸附率最高，為65.64%，其次為B2，吸附率為47.14%，其他菌株的吸附率在7.78%～30.27%之間。當(dāng)液體培養(yǎng)基中Cd2+初始濃度為100 mg·L－1時(shí)，各菌株Cd2+的吸附率均低于初始濃度10 mg·L－1。其中B9的Cd2+吸附率最高，為 44.30%，其次為 B2（26.02%），其他菌株的Cd2+吸附率均較低，在5%左右。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的目的，選取Cd2+吸附率最高的B9菌株進(jìn)行深入研究。

菌株B9菌落為黃色，呈圓形，有凸起，邊緣平整，光滑濕潤(rùn)（圖1a），掃描電鏡下菌體呈桿狀（圖1b）。葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)為陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)為陰性，革蘭氏染色陰性，全部與D.acidovorans生理生化特征一致。16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果表明，B9與D.acidovorans的序列具有99%的同源性（圖1c），結(jié)合菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)，可以確定目標(biāo)菌株為Delftia sp.，基因登錄號(hào)為MF679148。

表2 耐Cd菌株處理后液體培養(yǎng)基中Cd濃度的變化Table2 Variation of cadmium concentration in medium after treatment with cadmium-resistant bacteria

圖1 菌株B9的形態(tài)學(xué)特征（a）、掃描電鏡圖（b）及其16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（c）Figure1 Morphological characteristic（a）,scanning electron microscopy image（b）and the phylogenetic tree of 16S rRNA（c）of strain B9

2.2 不同Cd2+濃度下的生長(zhǎng)曲線

圖2是 Cd2+濃度分別為 0、10、100 mg·L-1下，培養(yǎng)54 h后菌株B9的生長(zhǎng)曲線。由圖2可見(jiàn)，Cd2+濃度為10 mg·L-1時(shí)B9對(duì)數(shù)期后的生長(zhǎng)量降低，與CK都是在培養(yǎng)的36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。Cd2+濃度為100 mg·L-1時(shí)延長(zhǎng)了B9生長(zhǎng)的延滯期，B9延遲12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，且進(jìn)入對(duì)數(shù)期后生長(zhǎng)量降低，進(jìn)入穩(wěn)定期后OD600在2.5左右，表明B9對(duì)Cd2+有較強(qiáng)的耐受性。

圖2 菌株B9生長(zhǎng)曲線Figure2 Growth curve of strain B9

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)目標(biāo)菌株B9去除Cd2+效果的影響

由圖3a可見(jiàn)，在培養(yǎng)溫度為30℃、Cd2+初始濃度為 10 mg·L－1時(shí)，當(dāng) pH 值從 5 增加到 8，B9 對(duì) Cd2+的吸附量和吸附率均顯著增加；當(dāng)pH=8時(shí)，Cd2+的吸附量和吸附率達(dá)到最大值6.73 mg·L－1和69.85%；當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，B9對(duì)Cd2+的吸附量和吸附率均明顯降低。當(dāng)pH=9時(shí)，B9對(duì)Cd2+的吸附率為42.39%，比pH=8 低 2.64 mg·L－1。可見(jiàn)，pH 是影響 B9 吸附 Cd2+的一個(gè)因素。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，B9在pH=8的環(huán)境中對(duì)Cd2+的吸附效果最好。

由圖3b可見(jiàn)，在培養(yǎng)溫度為30℃、pH=7、Cd2+初始濃度為 10 mg·L－1時(shí)，0～48 h 時(shí)，B9 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加對(duì)Cd2+的吸附量和吸附率顯著增加，到48 h時(shí)Cd2+的吸附量和吸附率達(dá)到最大值8.13 mg·L－1和84.37%；培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，吸附量比48 h時(shí)有所減少，但差異不顯著。

由圖 3c可見(jiàn)，在 pH=7、Cd2+初始濃度為 10 mg·L－1時(shí)，當(dāng)溫度從10℃增加到30℃，B9對(duì)Cd2+的吸附量和吸附率均顯著增加；當(dāng)溫度從30℃增加到40℃，兩者吸附量和吸附率均沒(méi)有顯著差異，均保持在較高的水平，吸附量在8 mg·L－1以上，吸附率在85%以上。

由圖3d可見(jiàn)，在培養(yǎng)溫度為30℃、pH=7、Cd2+初始濃度在10 mg·L－1以下時(shí)，吸附率都在60%以上，濃度越低吸附率越高，初始Cd2+濃度為1 mg·L－1時(shí)，吸附率達(dá)到87.07%；初始Cd2+濃度為50 mg·L－1時(shí)，吸附率下降到31.8%。而B(niǎo)9對(duì)Cd2+的吸附量隨著Cd2+濃度的增加而不斷增加，B9對(duì)Cd2+吸附量從0.85 mg·L－1增加到 31.28 mg·L－1。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株B9吸附Cd2+效果的影響Figure3 Influence of different culture conditions on the adsorption rate of Cd from strain B9

2.4 菌株B9對(duì)土壤Cd形態(tài)的影響

添加菌株B9后土壤弱酸可溶態(tài)Cd的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先減少后趨于平緩的趨勢(shì)。土壤培養(yǎng)至第10 d時(shí)，T1（添加3 mL菌懸液）和T2（添加10 mL菌懸液）處理土壤樣品中弱酸可溶態(tài)Cd的含量均顯著減少，分別減少44.40 mg·kg－1和45.33 mg·kg－1（表3）；在培養(yǎng)的第10 d到第30 d，T1、T2土壤樣品的弱酸可溶態(tài)Cd的含量隨著時(shí)間的推移有所變化，但沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異。T1、T2處理與CK相比，在培養(yǎng)的30 d內(nèi)弱酸可溶態(tài)Cd的含量均具有顯著性差異，T1與T2兩個(gè)處理之間除了第30 d，其他時(shí)間無(wú)顯著差異，因此添加菌株B9對(duì)土壤中弱酸可溶態(tài)Cd含量影響較大，B9兩種不同添加量影響較小。

添加菌株B9后，CK處理中可還原態(tài)Cd含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(shì)（表3），培養(yǎng)至第 10d 可還原態(tài) Cd 含量減少 2.89 mg·kg－1；第10 d到第30 d內(nèi)可還原態(tài)Cd含量增加14.72 mg·kg－1，這可能與培養(yǎng)時(shí)保持加水有關(guān)。T1和T2處理中可還原態(tài)Cd含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，T1、T2處理培養(yǎng)到第10 d時(shí)，可還原態(tài)Cd含量均顯著增加，比開(kāi)始土壤樣品的可還原態(tài) Cd 含量分別增加 13.71、17.60 mg·kg－1；T1在培養(yǎng)的第10 d到第30 d土壤中可還原態(tài)Cd含量雖有所變化，但沒(méi)有顯著性差異，培養(yǎng)至第30 d時(shí)，比開(kāi)始增加了15.17 mg·kg－1。T2在培養(yǎng)的第10 d到第20 d土壤中可還原態(tài)Cd含量雖有所變化，但與第10 d相比，沒(méi)有顯著差異；培養(yǎng)到第30 d時(shí)，可還原態(tài)Cd含量上升到 38.06 mg·kg－1，比開(kāi)始增加了 20.69 mg·kg－1。T1、T2和CK三個(gè)處理之間在培養(yǎng)的30 d內(nèi)可還原態(tài)Cd的含量均具有顯著性差異，因此，添加菌株B9及其添加量對(duì)土壤中可還原態(tài)Cd含量影響均較大。

添加菌株B9后，CK、T1和T2三個(gè)處理可氧化態(tài)Cd含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加均呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì)（表3）。CK處理的可氧化態(tài)Cd在培養(yǎng)的前5 d內(nèi)顯著減少，之后含量雖然有變化，但差異不顯著，培養(yǎng)至第 30 d 時(shí)，比開(kāi)始減少了 1.81 mg·kg－1。T1處理在培養(yǎng)前10 d內(nèi)可氧化態(tài)Cd含量顯著減少，減少量為2.44 mg·kg－1；培養(yǎng)的第 10 d 到第 30 d 差異不顯著。T2處理在培養(yǎng)的第30 d比開(kāi)始時(shí)可氧化態(tài)Cd含量顯著減少，減少量為 1.08 mg·kg－1。T1、T2和 CK 三個(gè)處理之間在培養(yǎng)的30 d內(nèi)可氧化態(tài)Cd的含量均無(wú)顯著性差異，因此，添加菌株B9及其添加量對(duì)土壤中可氧化態(tài)Cd含量沒(méi)有顯著影響。

表 3 菌株 B9 對(duì)土壤 Cd 形態(tài)的影響（mg·kg－1）Table3 Effect of strain B9 on the speciation of Cd in the soil（mg·kg－1）

土壤樣品中鎘的殘?jiān)鼞B(tài)含量變化如表3所示，CK處理中殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量隨著時(shí)間的變化沒(méi)有顯著差異，T1、T2處理殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)出顯著增加的趨勢(shì)。T1處理培養(yǎng)至第20 d時(shí)，殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量達(dá)到最大值34.20 mg·kg－1，比開(kāi)始增加了 18.67 mg·kg－1，之后含量減少；T2處理土壤樣品中Cd的殘?jiān)鼞B(tài)含量持續(xù)增加，培養(yǎng)至第30 d時(shí)，殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量達(dá)到最大值33.13 mg·kg－1，比開(kāi)始增加了17.20 mg·kg－1。T1、T2和 CK 三個(gè)處理之間在培養(yǎng)的30 d內(nèi)殘?jiān)鼞B(tài)Cd的含量均具有顯著性差異，因此，添加菌株B9及其添加量對(duì)土壤中可還原態(tài)Cd含量影響均較大。

圖4為經(jīng)過(guò)30 d培養(yǎng)Cd形態(tài)百分比的變化情況，可見(jiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，添加B9菌懸液的處理能顯著降低土壤中弱酸可溶態(tài)Cd含量，增加可還原態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量，可氧化態(tài)Cd含量變化不明顯。CK處理中弱酸可溶態(tài)Cd含量在培養(yǎng)30 d后降至最小值，減少了4.64%。T1處理中弱酸可溶態(tài)Cd含量在培養(yǎng)10 d后降至最小值，減少了22.17%。T2處理中的酸可溶態(tài)Cd含量在培養(yǎng)20 d后降至最小值，減少了25.06%。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，T2土壤中弱酸可溶態(tài)Cd的減少量一直大于T1。CK處理的可還原態(tài)Cd含量在培養(yǎng)的第10 d降至10.02%，培養(yǎng)至第30 d上升到17.45%。T1、T2處理中可還原態(tài)Cd含量增加明顯，培養(yǎng)至第30 d時(shí)分別達(dá)到19.47%和22.10%，比開(kāi)始增加了9.66%和12.17%。CK、T1、T2處理中可氧化態(tài)Cd含量由4.95%、4.88%、4.33%分別降至3.84%、3.66%、3.77%，但 T1、T2與 CK 相比，減少量都沒(méi)有明顯差異。T1、T2處理中殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量明顯增加，由8.88%、9.11%分別升至22.43%、22.72%，增加了13.55%、13.61%。CK中殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量變化不明顯。

圖4 添加菌株B9后各形態(tài)Cd百分比動(dòng)態(tài)變化Figure4 Dynamic changes of percentage of Cd under exogenous addition strain B9

3 討論

微生物對(duì)重金屬離子的吸附，不僅因微生物種類的不同而異，還受微生物生長(zhǎng)和吸附條件的限制，如pH、溫度、吸附時(shí)間、初始重金屬濃度等。為了達(dá)到B9對(duì)Cd2+的最佳吸附效果，研究了B9吸附培養(yǎng)液中Cd2+的環(huán)境條件。培養(yǎng)液的pH值是影響菌株B9吸附Cd2+的一個(gè)重要因素（圖3a），較低的pH值不利于重金屬Cd2+的吸附，這可能是由于在較低的pH值下，液體培養(yǎng)基中的H+與Cd2+競(jìng)爭(zhēng)表面吸附位點(diǎn)。而pH較高時(shí)B9對(duì)Cd的吸附率也減少，可能是Cd2+主要以氫氧化物沉淀的形式存在，氫氧化物沉積于菌體細(xì)胞表面，影響了Cd2+與吸附位點(diǎn)的結(jié)合，使得吸附率下降[21]。培養(yǎng)時(shí)間也會(huì)影響B(tài)9對(duì)Cd2+的吸附效果（圖3b），72 h時(shí)的吸附率略低于48 h時(shí)的吸附率，這可能是由于菌株生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使菌株生長(zhǎng)速率降低或生物量不再增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)了解吸現(xiàn)象；或者菌株在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生有生物毒性的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物隨著時(shí)間積累，對(duì)菌株的生長(zhǎng)繁殖造成影響，從而導(dǎo)致B9對(duì)Cd2+的吸附量減少[22]。溫度對(duì)B9吸附Cd2+的影響（圖3c）主要表現(xiàn)在菌體的吸附活性上，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低B9對(duì)Cd2+吸附過(guò)程所需的活化能，進(jìn)而對(duì)吸附能力造成影響。很多研究[23－24]顯示Delftia.sp生長(zhǎng)的適宜溫度在37℃左右，與本研究結(jié)果相近。Cd2+濃度變化過(guò)程中（圖3d），吸附量比吸附率更能體現(xiàn)出B9對(duì)Cd2+的吸附作用，研究表明，微生物對(duì)重金屬離子的吸附能力與細(xì)胞表面的吸附位點(diǎn)的飽和度有關(guān)，Cd2+初始濃度較低時(shí)，B9表面帶負(fù)電荷的活性吸附位點(diǎn)多，能與培養(yǎng)液中Cd2+充分結(jié)合，使吸附量增加。Cd2+初始濃度的增加導(dǎo)致吸附位點(diǎn)逐漸被占用，從而導(dǎo)致吸附率減少[25]，同時(shí)，Cd2+濃度高時(shí)，會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)量產(chǎn)生影響（圖2），使菌體OD600值下降，這也會(huì)減少其對(duì)Cd2+的吸附量。

雖然土壤中重金屬元素的總量可以作為評(píng)價(jià)該土壤污染水平的關(guān)鍵因素，但不能真正反映其潛在的生態(tài)危害性，重金屬元素的不同存在形態(tài)的環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)不同，所以分析土壤中重金屬的不同形態(tài)很有必要[26]。本試驗(yàn)研究顯示，B9接種到土壤后能夠使Cd的形態(tài)發(fā)生變化，且各種形態(tài)在培養(yǎng)的第10 d幾乎達(dá)到平衡，即弱酸可溶態(tài)Cd含量減少，可還原態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量顯著增加，而可氧化態(tài)Cd含量變化不顯著，這與曹霞[27]和范文宏等[18]得出的結(jié)論類似。添加菌株B9前，土壤中Cd形態(tài)百分比表現(xiàn)為弱酸可溶態(tài)＞可還原態(tài)＞殘?jiān)鼞B(tài)＞可氧化態(tài)，處理后土壤中Cd形態(tài)百分比表現(xiàn)為弱酸可溶態(tài)＞可還原態(tài)≈殘?jiān)鼞B(tài)＞可氧化態(tài)。土壤中Cd的弱酸可溶態(tài)雖然一直占比最高，但添加B9后Cd的形態(tài)還是由有效態(tài)向難溶態(tài)轉(zhuǎn)化，這能有效降低Cd在土壤中的毒性。添加B9能使Cd的形態(tài)發(fā)生變化可能是由于B9的生命活動(dòng)的分泌物或代謝產(chǎn)物使重金屬形態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，如曹裕松等[28]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將Cd2+還原成難溶的CdS。B9使Cd形態(tài)發(fā)生變化也可能是由于B9對(duì)重金屬Cd的吸附富集作用，微生物可通過(guò)帶電荷的細(xì)胞表面吸附重金屬離子，或通過(guò)攝取必要的營(yíng)養(yǎng)元素主動(dòng)吸收重金屬離子，將重金屬離子富集在細(xì)胞表面或內(nèi)部，一些微生物能產(chǎn)生胞外聚合物（如多糖、糖蛋白、脂多糖等），其帶有大量的陰離子基團(tuán)，能與金屬離子結(jié)合；某些微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（如檸檬酸）也是一種很好的金屬螯合劑。有關(guān)B9對(duì)土壤中Cd形態(tài)變化的影響機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）從重金屬污染的土壤中分離得到對(duì)Cd2+具有較高吸附率的菌株為B9，經(jīng)鑒定該菌種為Delftia sp.。

（2）通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)條件下菌株吸附Cd2+效果的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)B9在pH=8、溫度為35℃、培養(yǎng)時(shí)間為48 h條件下，對(duì)Cd2+的吸附效果最好，并且Cd2+濃度在10 mg·L-1及以下時(shí)，吸附率在60%以上。

（3）目標(biāo)菌株B9能影響土壤中Cd的形態(tài)，Cd從弱酸可溶態(tài)向可還原態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)轉(zhuǎn)化。不同添加量處理下，弱酸可溶態(tài) Cd含量減少 44.40、45.33 mg·kg-1，可還原態(tài)Cd含量增加15.71、20.69 mg·kg-1，可氧化態(tài)Cd含量無(wú)明顯變化，殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量增加18.67、17.2 mg·kg-1。

[1]王京文,李 丹,柳 俊,等.耐鎘菌株對(duì)土壤鎘形態(tài)及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2015,34（9）：1693-1699.

WANG Jing-wen,LI Dan,LIU Jun,et al.Effects of cadmium tolerant bacteria on soil cadmium forms and microbial community structure[J].Journal of Agro-Environment Science,2015,34（9）：1693-1699.

[2]王 維.水稻鎘吸收的區(qū)域模型及其調(diào)控研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué),2012.

WANG Wei.Rice cadmium uptake by regional model and its regulation[D].Nanjing：Nanjing Forestry University,2012.

[3]安紅敏,鄭 偉,高 揚(yáng).鎘的健康危害及干預(yù)治療研究進(jìn)展[J].環(huán)境與健康雜志,2007,24（9）：739-742.

AN Hong-min,ZHENG Wei,GAO Yang.Research progress in cadmium toxicity[J].J Environ Health,2007,24（9）：739-742.

[4]凌 輝,謝水波,唐振平,等.重金屬污染土壤的修復(fù)方法及其在幾類典型土壤修復(fù)中的應(yīng)用[J].四川環(huán)境,2012,31（1）：118-122.

LING Hui,XIE Shui-bo,TANG Zhen-ping,et al.Remediation of heavy metal polluted soil and application for typical soils[J].Sichuan Environment,2012,31（1）：118-122.

[5]余天紅,黎華壽.砷污染土壤微生物修復(fù)機(jī)制及其研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染與防治,2014,36（12）：77-82.

YU Tian-hong,LI Hua-shou.Mechanism of bioremediation in aresenic contaminated soil and its research progress[J].Environmental Pollution&Control,2014,36（12）：77-82.

[6]Paqnanelli F,Cruz V C,Toro L.Isolation and quantification of cadmium removal mechanisms in batch reactors inoculated by sulphate reducing bacteria：Biosorption versus bioprecipitation[J].Bioresource Technology,2010,101（9）：2981-2987.

[7]晉銀佳,劉 文,朱 躍,等.熒光假單胞菌產(chǎn)鐵載體對(duì)油麥菜吸收砂基和水基中Cd的影響[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2016,10（1）：415-420.

JIN Yin-jia,LIU Wen,ZHU Yue,et al.Effects of siderophore produced by pseudomonas fluorescence on cadmium uptake from sand-base and water-base systems by lettuces[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2016,10（1）：415-420.

[8]Wen A,Fegan M,Hayward C,et al,Phylogenetic relationships among members of the Comamonadaceae,and description of Delftia acidovorans（den Dooren de Jong 1926 and Tamaoka et al.1987） gen.nov.,comb.nov[J].Int J Syst Bacteriol,1999,49（2）：567-576.

[9]Zhang T,Zhang J L,Liu S J,et al.A novel and complete gene cluster involved in the degradation of aniline by Delftia sp.AN3[J].Journal of Environmental Sciences,2008,20（6）：717-724.

[10]梁泉峰.生物降解菌株Delftia tsuruhatensis AD9中染色體編碼的苯胺代謝基因簇的克隆和功能研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2005.

LIANG Quan-feng.Cloning and functional analysis of chromosomeencoded gene cluster for aniline metabolic pathway in Delftia tsturuhatensis AD9[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Science,2005.

[11]Xiao C B,Ning J,Yan H,et al.Biodegradation of aniline by a newly isolated Delftia sp.XYJ6[J].Chinese Journal of Chemical Engineering,2009,17（3）：500-505.

[12]González A J,Gallego A,Gemini V L,et al.Degradation and detoxification of the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D）by an indigenous Delftia sp.strain in batch and continuous systems[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2012,66（1）：8-13.

[13]葉杰旭,林彤暉,駱煜昊,等.1株氯苯高效降解菌的分離鑒定及降解特性[J].環(huán)境科學(xué),2017,38（2）：802-808.

YE Jie-xu,LIN Tong-hui,LUO Yu-hao,et al.Isolation and identification of a chlorobenzene-degrading bacterium and its degradation characteristics[J].Environmental Science,2017,38（2）：802-808.

[14]Prakash D,Pandey J,Tiwary B N,et al.Physiological adaptations and tolerance towards higher concentration of selenite（Se4+）in Enterobacter sp.AR-4,Bacillus sp.AR-6 and Delftia tsuruhatensis,AR-7[J].Extremophiles,2010,14（3）：261-272.

[15]Garavaglia L,Cerdeira S B,Vullo D L.Chromium（Ⅵ）biotransformation by β-and γ-proteobacteria from natural polluted environments：A combined biological and chemical treatment for industrial wastes[J].Journal of Hazardous Materials,2010,175（1/2/3）：104-110.

[16]Morel M A,Ubalde M C,Bra?a V,et al.Delftia sp.JD2：A potential Cr（Ⅵ）-reducing agent with plant growth-promoting activity[J].Archives of Microbiology,2011,193（1）：63-68.

[17]Ubalde M C,Bra?a V,Sueiro F,et al.The versatility of Delftia sp.isolates as tools for bioremediation and biofertilization technologies[J].Current Microbiology,2012,64（6）：597-603.

[18]范文宏,姜 維,王 寧.硫酸鹽還原菌修復(fù)污染土壤過(guò)程中鎘的地球化學(xué)形態(tài)分布變化[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2008,28（11）：2291-2298.

FAN Wen-hong,JIANG Wei,WANG Ning.Changes of cadmium geochemical speciation in the process of soil bioremediation by sulfate-reducing bacteria[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2008,28（11）：2291-2298.

[19]韓春梅,王林山,鞏宗強(qiáng),等.土壤中重金屬形態(tài)分析及其環(huán)境學(xué)意義[J].生態(tài)學(xué)雜志,2005,24（12）：1499-1502.

HAN Chun-mei,WANG Lin-shan,GONG Zong-qiang,et al.Chemical forms of soil heavy metals and their environmental significance[J].Chinese Journal of Ecology,2005,24（12）：1499-1502.

[20]Rauret G,López-sánchez J F,Sahuquillo A,et al.Improvement of the BCR three step sequential extraction procedure prior to the certification of new sediment and soil reference materials[J].J Environ Monit,1999,1（1）：57-61.

[21]吳 涓,李清彪,鄧 旭,等.重金屬生物吸附的研究進(jìn)展[J].離子交換與吸附,1998,14（2）：180-187.

WU Juan,LI Qing-biao,DENG Xu,et al.Research advances in biosorption of heavy metals[J].Ion Exchange and Adsorption,1998,14（2）：180-187.

[22]鄭曉丹.變形假單胞菌吸附鎘的機(jī)制及其吸附條件的研究[D].福州：福建師范大學(xué),2010.

ZHENG Xiao-dan.Research on the mechanism and the conditions of cadmium adsorpted by Pseudomonas Plecoglossicida[D].Fuzhou：Fujian Normal University,2010.

[23]呂晶華,段云霞,許丹宇,等.高效苯胺降解菌的分離鑒定及其降解特性[J].城市環(huán)境與城市生態(tài),2016,29（1）：32-34.

Lü Jing-hua,DUAN Yun-xia,XU Dan-yu,et al.Isolation and identification of bacteria degrading aniline[J].Urban Environment&Urban Ecology,2016,29（1）：32-34.

[24]侯 穎,王 飛,李靜泉,等.Delftia sp.T3-6菌株及其粗酶液對(duì)2′,6′-甲乙基-2-氯乙酰苯胺的降解[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2014,34（6）：1396-1402.

HONG Ying,WANG Fei,LI Jing-quan,et al.Degradation characteristics of 2′,6′-methylethyl-2-chloroacetanilide by strain Delftia sp.T3-6 and its crude enzyme[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2014,34（6）：1396-1402.

[25]Vecchio A,Finoli C,Simine D D,et al.Heavy metal biosorption by bacterial cells[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,1998,361（4）：338-342.

[26]郭朝暉,朱永官.典型礦冶周邊地區(qū)土壤重金屬污染及有效性含量[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2004,13（4）：553-555.

GUO Zhao-hui,ZHU Yong-guan.Contamination and availabile contents of heavy metals in soils in the typical mining and smelting circumjacent districts[J].Ecology and Environment,2004,13（4）：553-555.

[27]曹 霞.耐鉛鎘微生物的篩選及其對(duì)污染土壤鉛鎘化學(xué)形態(tài)的影響[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

CAO Xia.Screening of lead and cadmium-resistant microorganism and their effect on chemical form of Pb and Cd in contaminated soil[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University,2009.

[28]曹裕松,李志安,鄒 碧.根際環(huán)境的調(diào)節(jié)與重金屬污染土壤的修復(fù)[J].生態(tài)環(huán)境,2003,12（4）：493-497.

CAO Yu-song,LI Zhi-an,ZOU Bi.Regulation of rhizospherre and remediation of polluted soil by heavy metal[J].Ecology and Environment,2003,12（4）：493-497.