覃俊奇，韋信賢，黎小正，吳祥慶，蘭宗寶，楊慧贊，黃國秋，黃鸞玉，陳 靜，童桂香*

(1.廣西水產(chǎn)科學研究院，廣西南寧530021;2.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技信息研究所，廣西南寧530007)

龜鱉產(chǎn)業(yè)是廣西漁業(yè)的特色產(chǎn)業(yè)和新興產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)民增收致富的重要途徑，主要養(yǎng)殖品種有廣西擬水龜、安布閉殼龜、緬甸陸龜、黃沙鱉、山瑞鱉等［1］。根據(jù)《廣西龜鱉資源調(diào)查》項目的統(tǒng)計，2013年廣西全區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖戶達9.83萬戶，產(chǎn)量2.82萬t，全國排名第8位;產(chǎn)值78億元，全國排名第7位［2-3］。近幾年，隨著人們對龜鱉寵養(yǎng)和藥膳保健需求的不斷增加，龜鱉市場交易相當活躍，產(chǎn)品價格也持續(xù)居高，龜鱉養(yǎng)殖效益喜人，致使廣西龜鱉養(yǎng)殖隊伍仍在不斷壯大。然而，在高效經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，養(yǎng)殖戶過于注重龜鱉的生長速度而忽視了對養(yǎng)殖環(huán)境的保護及各類疾病的防治，加上多數(shù)養(yǎng)殖戶沒有水產(chǎn)動物養(yǎng)殖的相關(guān)知識，導致龜鱉疾病如白眼病、肺炎、紅底板病等細菌性疾病在龜鱉養(yǎng)殖中常有發(fā)生［4-6］;養(yǎng)殖戶在龜鱉發(fā)病初期因救龜鱉心切，常不經(jīng)確診和藥敏試驗就盲目地按經(jīng)驗使用抗菌藥進行治療，效果多不理想，往往會造成極大的經(jīng)濟損失。為了解引起廣西龜鱉細菌性疾病的病原菌種類及其藥敏特性，對2015—2016年來自廣西各地的龜鱉病例進行病原菌的分離與純化，并采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)結(jié)合16S rDNA測序進行各病原菌的鑒定，同時采用紙片擴散法測定各病原菌對頭孢曲松、鏈霉素、土霉素、強力霉素、恩諾沙星等常用抗菌藥的敏感性，旨在為龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)中細菌性疾病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

2015—2016年來自廣西南寧市、來賓市、欽州市等地共63例龜鱉病例，包括廣西擬水龜(石龜)、安布閉殼龜、緬甸陸龜、中華草龜、鱷龜、黃沙鱉、山瑞鱉和珍珠鱉共8個品種。

1.2 主要試劑與儀器

血平板、革蘭氏染色液、藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司;腦心浸液瓊脂(BHIA)、營養(yǎng)肉湯、LB肉湯、LB瓊脂等培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司;細菌DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)預(yù)混液 2×Taq PCR Master Mix(含 Taq酶、dNTPs、MgCl2等)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司;pMD18－T載體、DH5α感受態(tài)細胞、氨芐青霉素購自大連寶生物工程有限公司;細菌16S rDNA的PCR引物是William等［7］報道的通用引物 fD1(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和rP2(5'－ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3')，由寶生物工程(大連)有限公司合成。BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)(包括濁度儀、細菌培養(yǎng)板、瓊脂培養(yǎng)基、接種液、接種棒、棉簽、V形加樣槽等)為美國BIOLOG公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離與純化 用75%的乙醇消毒患病龜鱉體表，無菌條件下從腐皮、肝、肺、腎等取樣劃線接種于血平板或BHIA平板，置30℃恒溫培養(yǎng)16～24 h;選取優(yōu)勢菌落進一步純化培養(yǎng)、涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌落形態(tài)特征、細菌的形態(tài)和染色特征。

1.3.2 細菌的保種與復蘇 挑取純化培養(yǎng)的單個菌落接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于30℃恒溫培養(yǎng)16～24 h，加20%甘油分裝后于－80℃保種。復蘇時將保存的菌種置于冰上15 min，用接種環(huán)無菌挑取凍存管內(nèi)的少量菌液在血平板上劃線培養(yǎng)16～24 h。

1.3.3 細菌BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)鑒定 參照童桂香等［8］的方法進行，具體操作如下:將細菌純培養(yǎng)后進行革蘭氏染色及氧化酶試驗，以選擇合適的培養(yǎng)基和細菌培養(yǎng)板;取純化培養(yǎng)的單菌落劃“十”字接種于瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)16～24 h;用接種棒挑取“十”字四邊外半部分的菌落，在滅菌的試管內(nèi)將菌落均勻分散;吸取3～5 mL接種液將試管內(nèi)分散好的菌落洗下并混合均勻，制備細菌懸濁液;用濁度儀將細菌懸濁液調(diào)至合適的濁度，靜置5 min后傾入V形加樣槽，保留最后的1 mL菌懸液在試管中;在細菌培養(yǎng)板中每孔加入150 μL菌懸液，置于濕盒中在最適溫度培養(yǎng)16～24 h;取出細菌培養(yǎng)板，觀察結(jié)果并運用Biolog Microlog 24.2軟件分析，鑒定細菌種屬。

1.3.4 細菌16S rDNA鑒定 將純化培養(yǎng)的細菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16～24 h，離心收集細菌，用細菌DNA提取試劑盒按說明書操作提取總DNA。在PCR反應(yīng)管中分別加入2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 fD1、rP2(50 μmol/L) 各1 μL，細菌 DNA 2 μL，加滅菌 DEPC 水至 50 μL;短暫離心后置于PCR儀中進行擴增:95℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s進行 35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳用凝膠回收試劑盒回收純化，取純化的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落進行PCR鑒定;將陽性克隆送大連寶生物工程有限公司測序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST檢索比較分析。

1.3.5 藥敏試驗 采用K－B紙片擴散法進行分離菌株對氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、紅霉素、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、慶大霉素、土霉素、強力霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、氯霉素、復方新諾明、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、林可霉素、多黏菌素B、磷霉素、萬古霉素、特治星、特美汀和舒普深共27種常用抗菌藥物的敏感性試驗，并參照CLSI抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準［9］判定各菌株對供檢藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西龜鱉病例致病菌檢測結(jié)果

63例龜鱉病例經(jīng)細菌分離，從其中的38例樣品中分離到48株病原菌，7例病例分離到2種或以上的病原菌，25例沒有分離到細菌，細菌檢出率為60.3%(38/63);48株病原菌經(jīng)BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)或16S rDNA擴增、克隆(圖1)及測序鑒定，其中包括嗜水氣單胞菌10株、肺炎克雷伯菌8株、變形桿菌7株、溫和氣單胞菌4株、弗氏檸檬酸桿菌3株、陰溝腸桿菌3株、摩氏摩根菌3株、大腸桿菌3株、遲緩愛德華菌2株、塞氏檸檬酸桿菌2株、簡達氣單胞菌2株和棲木槿假單胞菌1株(表1);部分菌株16S rDNA序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫:嗜水氣單胞菌(KP091884)、肺炎克雷伯菌(KP091885、KP091888)、弗氏檸檬酸桿菌(KP091886)、遲緩愛德華菌(KP091887)。

圖1 分離菌16S rDNA及其重組質(zhì)粒pMD18－T－16S rDNA的PCR擴增結(jié)果

表1 廣西龜鱉疾病細菌性病原調(diào)查結(jié)果

2.2 廣西龜鱉病原菌藥敏試驗結(jié)果

采用K－B紙片擴散法測定了分離的48株病原菌對氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復方新諾明和恩諾沙星等27種抗菌藥的藥敏特性，結(jié)果見表2。各病原菌表現(xiàn)出不同的耐藥譜，但均存在多重耐藥性;其中對特治星的敏感率最高，達58.3%，其次是頭孢曲松和米諾環(huán)素，均為52.1%，最低的是多黏菌素 B，為 6.3%;對四環(huán)素的耐藥率最高，達85.4%，其次是多黏菌素B，為70.8%，最低的是頭孢曲松，為14.6%(表 2)。

表2 廣西龜鱉病原菌藥敏試驗結(jié)果

續(xù)表2 廣西龜鱉病原菌藥敏試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

對2015—2016年來自廣西南寧市、來賓市、欽州市等地共63例龜鱉病例進行了細菌性病原檢測，從其中的38例樣品中分離到包括嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌、變形桿菌、溫和氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌、摩氏摩根菌、大腸桿菌、遲緩愛德華菌、塞氏檸檬酸桿菌、簡達氣單胞菌和棲木槿假單胞菌共12種48株病原菌，7例病例分離到2種或以上的病原菌，細菌檢出率為60.3%;其中，嗜水氣單胞 菌［6，10-14］、肺 炎 克 雷 伯 菌［5］、溫 和 氣 單 胞菌［10，15-17］、摩氏摩根菌［18］和塞氏檸檬酸桿菌［19］已從廣西養(yǎng)殖的龜鱉中分離到，但變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、遲緩愛德華菌、簡達氣單胞菌和棲木槿假單胞菌分離自廣西養(yǎng)殖的龜鱉為首次報道。此外，黎小正等［20］從廣西某養(yǎng)龜場的黃喉擬水龜中分離到松鼠葡萄球菌，羅華平等［21］從廣西某養(yǎng)鱉場的黃沙鱉幼鱉中分離到類志賀鄰單胞菌;而未見從廣西養(yǎng)殖的龜鱉中分離到病毒的文獻，也未見有寄生蟲引起龜鱉大量死亡的報道。說明廣西龜鱉疾病仍以細菌性疾病為主，且病原復雜、存在混合感染;病原菌多為條件性致病菌，以嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌為主。因此，龜鱉養(yǎng)殖過程中應(yīng)遵循各種龜鱉的生長特征及習性，不斷提高繁殖養(yǎng)殖技術(shù)，避免近親繁殖，做好種質(zhì)資源保護，堅決杜絕“拔苗助長”式養(yǎng)殖;同時，不斷加強養(yǎng)殖環(huán)境的保護和提高預(yù)防病害的意識，大力推廣仿生態(tài)健康養(yǎng)殖觀念及養(yǎng)殖技術(shù)，減少各種疾病的發(fā)生。

目前，使用各種抗菌素類藥物抑制或者殺滅致病菌仍是防治細菌性疾病最有效的手段?？咕帉旝M細菌性傳染病的治療和控制起到了非常重要的作用［22］，但養(yǎng)殖過程中不科學地使用抗菌藥，極易造成致病菌產(chǎn)生耐藥性。本研究進行了48株龜鱉病原菌對27種抗菌藥的藥敏試驗，結(jié)果表明，各病原菌都存在嚴重的多重耐藥性，對四環(huán)素的耐藥率最高(85.4%)，其次是多黏菌素 B(70.8%)，最低的是頭孢曲松(14.6%)。有文獻報道，分離自廣西養(yǎng)殖龜鱉的嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌、溫和氣單胞菌、摩氏摩根菌和塞氏檸檬酸桿菌也均存在多重耐藥性［5，12-21］，說明廣西龜鱉源細菌對抗菌藥已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛的耐藥性。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，龜鱉養(yǎng)殖過程中濫用抗菌藥現(xiàn)象確實非常普遍，如將抗菌藥作為預(yù)防藥物長期使用、龜鱉發(fā)生疾病時憑經(jīng)驗使用多種抗菌藥物進行治療、為了快速見效常加大用藥劑量或縮短用藥間隔等，這些盲目使用抗菌藥的效果多不理想，不但造成藥物浪費，而且延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成很大的經(jīng)濟損失;還會導致耐藥菌株不斷出現(xiàn)及耐藥性不斷增強、產(chǎn)品藥物殘留超標和環(huán)境污染等問題，對龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅，甚至威脅人類公共衛(wèi)生安全。此外，藥敏試驗結(jié)果顯示，多數(shù)龜鱉分離菌對一些禁用藥如紅霉素、氯霉素、氧氟沙星、諾氟沙星及人用藥特治星、特美汀和舒普深也存在部分或嚴重的耐藥性，提示在廣西龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中有可能使用過這些藥物，應(yīng)引起相關(guān)監(jiān)管部門的重視并采取措施介入監(jiān)管。因此，在龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中應(yīng)推行“防病不用抗菌藥，治病慎用抗菌藥”的原則，即在預(yù)防疾病時以使用中草藥、免疫增強劑、微生態(tài)制劑等增強龜鱉體質(zhì)和改善養(yǎng)殖環(huán)境為主，治病時應(yīng)及時送實驗室診斷并根據(jù)藥敏試驗盡早選取敏感藥物以適當劑量給藥治療，做到科學、合理用藥，減少多重耐藥菌株的產(chǎn)生，避免給人和動物帶來的危害。

本研究表明，廣西龜鱉疾病仍以細菌性疾病為主，且病原復雜、存在混合感染，其中以嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌為主;48株分離自廣西發(fā)病龜鱉樣品的病原菌具有不同的敏感藥物譜和耐藥譜，均表現(xiàn)出多重耐藥性。

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