梁小迪，史鼎鼎，徐少慧，黃成濤，蔣代華

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530004)

土壤重金屬污染現(xiàn)已成為全球重要的環(huán)境問(wèn)題，且具持久性、高毒性、不可逆性、累積性等特點(diǎn)［1-2］。生物修復(fù)技術(shù)(特別是植物修復(fù)技術(shù))因其經(jīng)濟(jì)性、清潔性等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。黑麥草(Lolium multiflorum L.)具有先鋒植物特征，生長(zhǎng)快、分蘗多、生物量大、根須發(fā)達(dá)且入土不深，可多次刈割［3-4］，能耐受、吸收、累積土壤中濃度較高的重金屬，是修復(fù)重金屬污染土壤較為理想的植物。李紅霞等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在污泥中種植黑麥草后，污泥中重金屬總量減少，微生物量增加，過(guò)氧化氫酶活性提高，重金屬污染狀況得到改善。然而，根據(jù)遞進(jìn)脅迫進(jìn)程理論，一些低濃度的重金屬往往會(huì)促進(jìn)植物某一生長(zhǎng)指標(biāo)，而高濃度則會(huì)抑制［6］。因此，如何提高土壤中重金屬生物有效性從而提高修復(fù)效率，成為生物修復(fù)技術(shù)亟待解決的問(wèn)題。目前，關(guān)于提高土壤中重金屬的生物有效性研究多有開(kāi)展，如施加人工螯合劑(EDTA、DTPA、EGTA、CDTA、NTA等)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(黃腐酸、檸檬酸)或其他措施(微生物菌液、肥料或農(nóng)藝措施)等，均能在一定程度上提高重金屬的生物有效性［7-8］。但現(xiàn)階段對(duì)重金屬污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)研究受限于修復(fù)植物生物量小、強(qiáng)化劑單一等因素，未對(duì)多種添加劑與植物聯(lián)合修復(fù)的效果進(jìn)行研究。鑒于此，以黑麥草為供試植物，研究重金屬污染條件下接種耐鎘(Cd)細(xì)菌與施用活化劑對(duì)黑麥草生物量、Cd吸收量、Cd轉(zhuǎn)換系數(shù)、根系Cd富集因子以及土壤有效態(tài)Cd含量、Cd形態(tài)組成的影響，以期為土壤重金屬污染修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物為黑麥草，選用顆粒飽滿、大小均一的種子，經(jīng)10%過(guò)氧化氫溶液浸泡30 min，用滅菌去離子水清洗后備用。

供試土壤為原南寧冶煉廠周邊的赤紅壤和廣西大新縣鉛鋅礦區(qū)的棕色石灰土，均為5～20 cm表層污染土壤，其基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。塑料盆規(guī)格為直徑22 cm、高 26 cm，N(尿素)、P2O5(KH2PO4)、K2O(KCl)施用量分別為 1、0.5、1 g/盆，供試土壤過(guò)5 mm篩，基肥與干土混勻后裝盆，每盆裝土5 kg。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

供試耐Cd細(xì)菌從廣西崇左市大新縣某廢棄鉛鋅礦區(qū)重金屬污染的棕色石灰土中分離、篩選、馴化獲取，該菌株形態(tài)為白色、圓形、半透明、邊緣圓潤(rùn)整齊，直徑為 1.0～3.0 μm，為革蘭氏陰性菌，能在 Cd2+質(zhì)量濃度為140 mg/L的固體培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長(zhǎng)。以該菌株配制 OD600=1.0(活菌數(shù)量為7.6×1014cfu/mL)的耐Cd菌劑。供試活化劑為有機(jī)肥、EDTANa2、黃腐酸、檸檬酸，其中有機(jī)肥為史丹利公司生產(chǎn)的去除重金屬和滅菌的復(fù)合有機(jī)肥顆粒，活化劑均于播種前混勻于土壤中。

1.2 試驗(yàn)方法

盆栽試驗(yàn)于2014年10月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。共設(shè)置12個(gè)處理，分別為CK(自來(lái)水)、J1(耐 Cd菌劑 50 mL/盆)、J2(耐 Cd菌劑 200 mL/盆)、Y1(有機(jī)肥 40 g/盆)、Y2(有機(jī)肥 80 g/盆)、JY1(耐 Cd 菌劑 50 mL/盆+有機(jī)肥 40 g/盆)、JY2(耐 Cd 菌劑 100 mL/盆+有機(jī)肥 80 g/盆)、E1(EDTA 5 mmol/盆)、E2(EDTA 15 mmol/盆)、H1(黃腐酸 5 g/盆)、H2(黃腐酸 50g/盆)、N(檸檬酸50 mmol/盆)，每個(gè)處理重復(fù)3次。每盆播種250顆黑麥草種子，生長(zhǎng)期間以稱質(zhì)量法保持田間持水量60%。黑麥草播種17 d后間苗，每盆留長(zhǎng)勢(shì)均一的壯苗200株。耐Cd菌劑于黑麥草播種后24、32、60 d分3次施加。82 d收割，距土面1～2 cm處割刈，分成地上部和地下部?jī)刹糠郑?00℃烘箱中殺青1 h后，65℃繼續(xù)烘干至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量。將干燥后的植物樣品粉碎混勻裝進(jìn)封口袋保存，用于測(cè)定地上部和地下部Cd含量，同時(shí)測(cè)定盆栽土壤pH值、有效態(tài)Cd2+含量、Cd形態(tài)等指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 植物Cd含量 稱取0.25 g已粉碎的植物樣品，采用H2SO4－H2O2消解法提取植物樣品中Cd，消解完成后定容過(guò)濾，過(guò)濾液用原子吸收光譜儀測(cè)定Cd2+含量。

1.3.2 土壤有效態(tài)Cd2+含量 赤紅壤有效態(tài)Cd2+的提取以0.1 mol/L稀鹽酸溶液為提取劑，棕色石灰土有效態(tài)Cd2+的提取以DTPA為浸提劑，浸提后過(guò)濾液用原子吸收光譜儀測(cè)定Cd2+含量。

1.3.3 土壤中不同形態(tài)Cd2+含量 土壤樣品Cd形態(tài)分析采用BCR改進(jìn)法［8］，將土壤樣品中Cd分為F1(弱酸可溶態(tài))、F2(可還原態(tài))、F3(可氧化態(tài))、F4(殘?jiān)鼞B(tài))4種形態(tài)進(jìn)行逐步提取，每種形態(tài)提取得到的上清液用原子吸收光譜儀測(cè)定Cd2+含量。

用以下公式計(jì)算Cd吸收量、富集因子(BF)［9］和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(TF)［10］。

植物地上部(根部)Cd吸收量=地上部(根部)干質(zhì)量×地上部(根部)Cd2+含量，

根系對(duì)Cd的富集因子=植物根系中的Cd含量/基質(zhì)中Cd的有效態(tài)含量，

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植物地上部Cd2+含量/植物地下部Cd2+含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析與圖形繪制，ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)黑麥草生物量的影響

從表2可知，不同處理的黑麥草生物量不同，耐Cd菌劑、有機(jī)肥、耐Cd菌劑+有機(jī)肥、黃腐酸處理的黑麥草生物量均較對(duì)照顯著提高，其中赤紅壤J1、J2、Y1、Y2、JY1、JY2、H1、H2 處理的總干質(zhì)量較CK 分別提高了 24.35%、43.19%、24.28%、45.94%、25.83%、38.04%、24.28%、28.30%，E1、E2、N 處理的總干質(zhì)量較 CK 分別降低了 15.88%、31.40%、16.94%;棕色石灰土 J1、J2、Y1、Y2、JY1、JY2、H1、H2 處理的總干質(zhì)量較 CK分別提高了26.47%、55.59%、33.79%、49.63%、49.08%、65.93%、22.89%、28.57%，E1、E2、N處理的總干質(zhì)量較CK分別降低16.39%、28.85%、10.81%。不同活化劑對(duì)赤紅壤和棕色石灰土中黑麥草生物量的影響基本一致，菌劑200 mL/盆(J2)、有機(jī)肥 80 g/盆(Y2)、菌劑 100 mL/盆+有機(jī)肥80 g/盆(JY2)對(duì)黑麥草生物量的提高效果最為明顯，黃腐酸(H1、H2)、菌劑 50 mL/盆(J1)、有機(jī)肥 40 g/盆(Y1)、菌劑 50 mL/盆+有機(jī)肥 40 g/盆(JY1)次之。而EDTA(E1、E2)和檸檬酸(N)使黑麥草的生物量降低，對(duì)黑麥草生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。

表2 不同處理對(duì)黑麥草生物量的影響 g

2.2 不同處理對(duì)黑麥草Cd含量的影響

黑麥草中各部位Cd含量越高，表明該部位累積Cd的能力越強(qiáng)。由圖1可知，黑麥草根系Cd含量高于地上部，說(shuō)明根系累積Cd的能力更強(qiáng)。赤紅壤中，J1、J2、JY1、JY2、E1、E2、N 處理黑麥草地上部Cd含量較 CK分別顯著提高 36.85%、51.43%、8.28%、19.08%、49.25%、66.45%、41.21%，地下部較CK 分別顯 著 提高 21.84%、43.28%、10.92%、21.64%、50.38%、74.17%、25.41%。棕色石灰土中，J1、J2、JY1、JY2、E1、E2、N 處理黑麥草地上部 Cd 含量較 CK 分別顯著提高 26.52%、45.42%、10.88%、20.16%、53.17%、70.97%、35.37%，地下部分別顯著提高13.87%、28.14%、10.10%、15.42%、32.80%、51.82%、18.78%。結(jié)果表明，耐Cd菌劑、EDTA和檸檬酸均能顯著提高黑麥草累積Cd的能力，以EDTA促進(jìn)效果最強(qiáng)，有機(jī)肥和黃腐酸則抑制了黑麥草對(duì)Cd的吸收。

圖1 不同處理對(duì)黑麥草Cd含量的影響

2.3 不同處理對(duì)黑麥草Cd吸收量的影響

如圖2，赤紅壤中，黑麥草地上部Cd吸收量較地下部顯著提高31.95%～87.98%。棕色石灰土中，除E1、E2、N處理，黑麥草地下部吸收總Cd量較地上部顯著提高 12.88%～44.84%，E1、E2、N 處理地上部Cd吸收量較地下部分別提高11.47%、14.58%、10.35%。耐Cd菌劑、有機(jī)肥、EDTA、檸檬酸能不同程度提高地上部 Cd吸收量，赤紅壤中，J1、J2、Y1、Y2、JY1、JY2、E1、E2、N 處理地上部 Cd 吸收量較 CK分別提高 70.72%、118.36%、6.93%、13.75%、36.55%、65.80%、25.16%、16.71%、19.61%，棕色石灰土中，J1、J2、Y1、Y2、JY1、JY2、E1、E2、N 處理的地上部Cd吸收量較 CK 分別提高58.06%、126.45%、22.17%、13.74%、66.13%、102.90%、31.93%、26.27%、24.41%，但黃腐酸處理(H1、H2)與CK差異不顯著。耐Cd菌劑顯著提高了地下部Cd吸收量，赤紅壤J1、J2、JY1、JY2處理地下部Cd吸收量較CK分別顯著提高 50.31%、97.13%、38.53%、59.83%，棕色石灰土J1、J2、JY1、JY2處理地下部Cd吸收量較CK分別顯著提高51.11%、97.16%、57.47%、70.43%，其中菌劑200 mL/盆處理(J2)效果最強(qiáng)，有機(jī)肥、EDTA、黃腐酸、檸檬酸處理與CK差異不顯著。綜上可見(jiàn)，耐Cd菌劑促進(jìn)黑麥草對(duì)Cd的吸收。

圖2 不同處理對(duì)黑麥草Cd吸收量的影響

2.4 不同處理對(duì)黑麥草根系Cd富集因子的影響

根系是土壤中Cd進(jìn)入植物體內(nèi)的重要通道，分析黑麥草根系對(duì)Cd的富集因子有助于研究黑麥草對(duì)Cd的吸收機(jī)制。富集因子越大，表明黑麥草根系積累Cd的能力越強(qiáng)。由圖3可以看出，棕色石灰土中根系Cd富集因子普遍高于赤紅壤，故棕色石灰土比赤紅壤更有利于黑麥草根系對(duì)Cd的積累。耐Cd菌劑、EDTA、檸檬酸顯著促進(jìn)黑麥草根系對(duì)Cd的累積，其中EDTA的促進(jìn)效果最為明顯，而有機(jī)肥和黃腐酸則抑制了根系Cd積累。

圖3 不同處理對(duì)Cd富集因子的影響

2.5 不同處理對(duì)黑麥草Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

黑麥草Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是判斷黑麥草對(duì)Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)能力的依據(jù)，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)越大，說(shuō)明黑麥草由根部向地上部運(yùn)輸Cd元素或Cd化合物的能力越強(qiáng)。如圖4所示，各處理中，赤紅壤的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均高于棕色石灰土，可能是因?yàn)樗嵝酝寥烙兄谔岣逤d的活性，促使Cd向地上部轉(zhuǎn)移，進(jìn)而提高了Cd的生物有效性，有利于Cd污染的生物修復(fù)。赤紅壤中，耐Cd 菌劑、有機(jī)肥 80 g/盆、EDTA 15 mmol/盆、檸檬酸處理能提高Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，其中，檸檬酸處理與CK差異顯著，其他處理差異不顯著。棕色石灰土中，EDTA和檸檬酸處理能顯著提高Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，耐Cd菌劑、有機(jī)肥、耐Cd菌劑+有機(jī)肥處理與CK差異不顯著，而黃腐酸不利于Cd在黑麥草中轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖4 不同處理對(duì)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

2.6 土壤Cd的形態(tài)分析

如圖5，棕色石灰土各處理中有效態(tài)Cd2+含量均比赤紅壤高，同種土壤中，不同處理有效態(tài)Cd2+含量差異顯著。赤紅壤和棕色石灰土中，耐Cd菌劑、菌劑+有機(jī)肥、EDTA、檸檬酸顯著提高了土壤中有效態(tài)Cd2+含量，有機(jī)肥、黃腐酸顯著降低了土壤中的有效態(tài)Cd2+含量。

圖5 不同處理對(duì)土壤有效態(tài)Cd2+含量的影響

如圖6，總體上土壤Cd形態(tài)分布表現(xiàn)為弱酸可溶態(tài)(F1)＞殘?jiān)鼞B(tài)(F4)＞可還原態(tài)(F2)＞可氧化態(tài)(F3)。赤紅壤中弱酸可溶態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)Cd的比例較棕色石灰土高。耐Cd菌劑、黃腐酸處理的土壤弱酸可溶態(tài)Cd比例顯著降低，與CK相比，赤紅壤J1、J2、H1、H2 處理分別降低了 9.89%、19.60%、7.86%、14.27%，棕色石灰土 J1、J2、H1、H2 處理分別降低了13.02%、22.44%、3.87%、8.95%;有機(jī)肥、有機(jī)肥+菌劑、EDTA、檸檬酸處理的土壤弱酸可溶態(tài)Cd比例顯著升高，與 CK 相比，赤紅壤 Y1、Y2、JY1、JY2、E1、E2、N 處理分別升高了 3.40%、7.42%、1.06%、5.33%、17.78%、28.59%、10.66%，棕色石灰土 Y1、Y2、JY1、JY2、E1、E2、N 處理分別升高了 6.16%、10.14%、4.68%、8.40%、15.64%、22.30%、8.59%。耐 Cd菌劑使土壤中弱酸可溶態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)Cd比例降低，可還原態(tài)、可氧化態(tài)Cd比例升高;有機(jī)肥、耐Cd菌劑+有機(jī)肥、檸檬酸使土壤中弱酸可溶態(tài)、可氧化態(tài)Cd比例升高，可還原態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)Cd比例降低;EDTA使土壤中弱酸可溶態(tài)Cd比例升高，其他形態(tài)Cd比例降低;黃腐酸使土壤中弱酸可溶態(tài)、可還原態(tài)Cd比例降低，可氧化態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)Cd比例升高。

圖6 不同處理土壤中Cd形態(tài)分布

2.7 黑麥草Cd吸收量與土壤中Cd形態(tài)的相關(guān)性分析

如表3，黑麥草中各部位Cd吸收量與土壤中弱酸可溶態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量呈負(fù)相關(guān)，與土壤中可還原態(tài)、可氧化態(tài)Cd含量呈正相關(guān)，即黑麥草Cd吸收量越大，土壤中弱酸可溶態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)Cd越少，可還原態(tài)、可氧化態(tài)Cd越多，表明黑麥草對(duì)Cd污染土壤的修復(fù)起到一定作用。赤紅壤中，黑麥草Cd吸收量與土壤可還原態(tài)Cd比例呈極顯著正相關(guān)，地上部、地下部、總量的相關(guān)系數(shù)分別為 0.827、0.803、0.829，與可氧化態(tài) Cd 比例呈顯著正相關(guān)，地上部、地下部、總量的相關(guān)系數(shù)分別為 0.661、0.643、0.664;與弱酸可溶態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)Cd比例的負(fù)相關(guān)性系數(shù)較小(＜0.500)。棕色石灰土中，黑麥草Cd吸收量與土壤可氧化態(tài)Cd比例呈極顯著正相關(guān)，地上部、地下部、總量相關(guān)系數(shù)分別為 0.848、0.928、0.916;地上部Cd吸收量與土壤中殘?jiān)鼞B(tài)Cd比例的相關(guān)系數(shù)為－0.646，達(dá)顯著水平;其他相關(guān)性較弱，相關(guān)系數(shù)均在0.600以下。

表3 黑麥草Cd吸收量與土壤中Cd形態(tài)分布的相關(guān)分析

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，植物修復(fù)一直受限于重金屬脅迫、生物有效性低等原因而未廣泛應(yīng)用［11］，本研究通過(guò)添加耐性細(xì)菌、各種活化劑(有機(jī)肥、EDTA、黃腐酸、檸檬酸)來(lái)降低重金屬的脅迫作用，以達(dá)到促進(jìn)植物去除土壤重金屬的效果。

細(xì)菌是根際環(huán)境中種類最多、數(shù)量最龐大的微生物，可影響植物的生長(zhǎng)和重金屬的生物有效性［12-15］。本研究中，添加耐Cd細(xì)菌后顯著提高了黑麥草的生物量、Cd吸收量，同時(shí)也提高了土壤有效態(tài)Cd含量，土壤Cd生物有效性顯著提高，表明細(xì)菌對(duì)植物生物量的提高、植物累積重金屬和土壤重金屬含量降低有著潛在的促進(jìn)效應(yīng)，為植物修復(fù)效率的提高奠定了基礎(chǔ)。施用肥料作為傳統(tǒng)農(nóng)藝措施，是通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高生物量而提高植物富集更多重金屬的可能性，且肥料能與重金屬作用，改變土壤重金屬的形態(tài)而提高重金屬的活性，對(duì)植物累積重金屬產(chǎn)生影響，本研究中，施肥顯著提高了植物生物量，這與前人研究結(jié)果［16］一致。施用螯合劑、酸堿類物質(zhì)、植物調(diào)節(jié)劑、腐殖酸等是較為常見(jiàn)的化學(xué)誘導(dǎo)措施，化學(xué)誘導(dǎo)試劑被投入土壤中后會(huì)發(fā)生一系列的化學(xué)作用，改變重金屬在土壤中的賦存形態(tài)，提高重金屬的生物有效性［17］。本研究中，施用有機(jī)肥、耐Cd菌劑+有機(jī)肥、黃腐酸能顯著提高黑麥草的生物量，耐Cd菌劑+有機(jī)肥、EDTA、檸檬酸可不同程度提高土壤有效態(tài)Cd含量，同時(shí)促進(jìn)黑麥草對(duì)Cd的吸收，提高土壤Cd生物有效性;而有機(jī)肥、黃腐酸處理黑麥草對(duì)Cd的吸收量與對(duì)照差異不顯著，但抑制了土壤有效態(tài)Cd2+含量，降低了土壤Cd的毒性。因此，添加活化劑可不同程度地促進(jìn)植物修復(fù)的效率。

總之，耐Cd菌劑、有機(jī)肥、耐Cd菌劑+有機(jī)肥、黃腐酸均能顯著提高黑麥草的生物量，降低土壤Cd對(duì)黑麥草的脅迫，同時(shí)耐Cd菌劑、有機(jī)肥、耐Cd菌劑+有機(jī)肥、EDTA、黃腐酸、檸檬酸能夠不同程度地提高Cd的生物有效性或降低土壤中Cd的毒害作用，其中以菌劑200 mL/盆的效果最為顯著，即在重金屬的植物修復(fù)中添加耐性細(xì)菌的促進(jìn)效果最為顯著，具良好應(yīng)用前景。

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