汪燕秋，吳麗云，陳曉剛，孫 彤，李 沖，俞道進(jìn)

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建省中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

沙門菌污染是一個(gè)全球關(guān)注的重要問(wèn)題，對(duì)人類的威脅已超過(guò)數(shù)百年。據(jù)估計(jì)，全球每年發(fā)生的沙門菌感染病例超過(guò)9 000萬(wàn)例，導(dǎo)致死亡人數(shù)達(dá)15.5萬(wàn)人[1]。而中國(guó)發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒中，有70%～80%致病菌是沙門菌[2]。在美國(guó)，沙門菌是導(dǎo)致食源性感染的第二大病原菌[3]。動(dòng)物飼料作為沙門菌的重要傳染源受到廣泛關(guān)注[4]。動(dòng)物飼料產(chǎn)業(yè)鏈中從原料生產(chǎn)開(kāi)始各個(gè)階段均有較高沙門菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。為控制飼料源致病菌的傳播，抗生素自1950年美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)首次被批準(zhǔn)用作飼料添加劑，半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)一直被大量添加于養(yǎng)殖動(dòng)物飼料中[5]。不可否認(rèn)，抗生素對(duì)畜牧業(yè)起到十分積極的作用。但是，近年來(lái)，抗生素出現(xiàn)越來(lái)越多的負(fù)面效應(yīng)，首當(dāng)其沖就是耐藥菌株的不斷出現(xiàn)[6-7]，抗生素被逐步替代的呼聲越來(lái)越高。在2014年農(nóng)業(yè)部2045號(hào)公告中，國(guó)家將甲酸、乙酸和檸檬酸等39種酸認(rèn)定為安全的飼料添加劑品種，可應(yīng)用于所有養(yǎng)殖動(dòng)物飼料中，因此酸已成為替代抗生素的重要飼料添加劑組成部分[8]。

隨著酸的使用越來(lái)越廣泛，酸是否會(huì)如抗生素一樣出現(xiàn)越來(lái)越多的耐酸菌株，答案是肯定的。致病菌在應(yīng)對(duì)酸性壓力環(huán)境時(shí)，為增加生存能力需要誘導(dǎo)酸耐受反應(yīng)(acid tolerance response, ATR)。ATR是細(xì)菌在應(yīng)對(duì)低pH值時(shí)產(chǎn)生的耐受[9-10]，研究表明沙門菌暴露在較高的酸性環(huán)境中時(shí)就會(huì)產(chǎn)生ATR[11]。同時(shí)，也有證據(jù)表明，ATR可能會(huì)增加細(xì)菌的毒力[12]，而細(xì)菌在不同生長(zhǎng)階段的ATR具有不同特征[13-14]，在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生不同反應(yīng)，需要酸休克蛋白全程合成[15-16]。ATR還可以使細(xì)菌對(duì)熱、鹽、乙醇等壓力產(chǎn)生交叉耐受[17-18]。研究表明，沙門菌ATR可分為對(duì)數(shù)期ATR和穩(wěn)定期ATR，對(duì)數(shù)期ATR(LP ATR)可以進(jìn)一步分為依賴于fur的短暫耐酸系統(tǒng)和僅依靠rpoS的更持久有效的ATR[19]。同樣，穩(wěn)定期的鼠傷寒沙門菌具有兩個(gè)獨(dú)立調(diào)節(jié)的穩(wěn)定期酸耐受系統(tǒng)。與pH無(wú)關(guān)的rpoS負(fù)責(zé)的酸耐受，以及依賴酸誘導(dǎo)的穩(wěn)定期ATR，與ompR相關(guān)[14]。本研究選取與對(duì)數(shù)期ATR相關(guān)的fur基因及與穩(wěn)定期ATR相關(guān)的ompR基因研究沙門菌的耐酸性。同時(shí)，N. Botteldoorn等[20-21]對(duì)比沙門菌rpoD、16S rRNA和gmK3個(gè)管家基因表達(dá)的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，gmK是表達(dá)最穩(wěn)定的管家基因。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以gmK作為管家基因，選取與對(duì)數(shù)期ATR相關(guān)的fur基因及與穩(wěn)定期ATR相關(guān)的ompR基因研究沙門菌的耐酸性。并且，目前大部分對(duì)于ATR的研究是使用無(wú)機(jī)酸(如鹽酸)做酸化劑在30或37 ℃條件下進(jìn)行[15, 22]，而在實(shí)際環(huán)境中，食源性致病菌更常暴露于20 ℃或者更低的溫度環(huán)境下以及弱有機(jī)酸(如乙酸)環(huán)境下。同樣，飼料的儲(chǔ)存條件一般也更常暴露于20 ℃或者更低的溫度環(huán)境下，并且隨著酸的使用越來(lái)越廣泛，飼料所帶的致病菌在酸性環(huán)境產(chǎn)生ATR在預(yù)測(cè)模型和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面，對(duì)微生物安全具有重要意義。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology, RSM)是設(shè)計(jì)試驗(yàn)、建立模型和優(yōu)化條件的最有效的方法之一，受到幾個(gè)獨(dú)立變量的影響[23-25]。與傳統(tǒng)方法相比，響應(yīng)面分析法不僅可以明確獨(dú)立變量對(duì)試驗(yàn)的影響，確定最優(yōu)的試驗(yàn)操作條件，而且可以有效的評(píng)估各變量之間的相互作用，以實(shí)現(xiàn)最佳的試驗(yàn)性能[26-28]。因此，本研究旨在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法創(chuàng)造最優(yōu)條件評(píng)估沙門菌在乙酸創(chuàng)造的酸性壓力條件下的行為，評(píng)價(jià)它們存活率的變化和參與酸耐受基因的轉(zhuǎn)錄變化。同時(shí)，將優(yōu)化后的模型應(yīng)用于其他幾種常用有機(jī)酸上，以此驗(yàn)證該模型對(duì)于其他幾種常用酸所創(chuàng)造的誘導(dǎo)模型效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本試驗(yàn)所用細(xì)菌為腸炎沙門菌ATCC13076(福建省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供)。

1.1.2 試劑及溶液 腦心浸液肉湯(BHI)(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)、冰乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、TE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、瓊脂糖凝膠(Biowest Agarose)、SUPER Green I核酸染料(PCR級(jí))(北京泛博生物化學(xué)有限公司)、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eras、Easy Dilutio、SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、DL1000 Marker、6×LoadingBuffer、RNAiso Plus(大連寶生物工程公司)、氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、DEPC-treated water(上海生工生物工程公司)、5×TAE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3 設(shè)備 單人雙面超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、離心機(jī)(Allegra X-22，Beckman Co μlter)、恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、超純水系統(tǒng)(MLli-Q)、電子天平(德國(guó)科恩ABT 320-4M)、PCR儀(美國(guó) BIO-RAD Thermal Cycler型號(hào)：C1000)、電泳儀(北京六一儀器廠)、Real-time PCR系統(tǒng)(美國(guó) BIO-RAD CFX96TMReal-time System)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) BIO-RAD Gel Doc XR+molecular imager)。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌的培養(yǎng) 取-80 ℃凍存沙門菌復(fù)活，培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期，取1 mL接種于100 mL BHI肉湯中培養(yǎng)得到菌液濃度約為104CFU·mL-1的菌懸液。

1.2.2 誘導(dǎo)產(chǎn)生酸耐受 將100 mL無(wú)菌BHI(pH=7)肉湯轉(zhuǎn)移到250 mL無(wú)菌錐形瓶中，加入菌液濃度約為104CFU·mL-1的活菌做兩個(gè)平行，用橡膠塞塞住后置于搖床中在細(xì)菌誘導(dǎo)溫度條件下、190 r·min-1適應(yīng)20 h，此時(shí)細(xì)菌處于穩(wěn)定期階段。預(yù)先用乙酸將無(wú)菌BHI肉湯的pH值調(diào)整至4.0，再用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，分裝到無(wú)菌試管中，每管裝3 mL肉湯，備用。將適應(yīng)20 h后的細(xì)菌加入pH=4.0的BHI肉湯中，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，應(yīng)用MTT法[29]結(jié)合平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)沙門菌活菌數(shù)。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 分別以細(xì)菌培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)、母菌液添加量(1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%)、培養(yǎng)時(shí)間(3、4、5、6、7、8 h)作為影響因素，研究各單因素對(duì)細(xì)菌酸耐受情況的影響。

1.2.4 模型優(yōu)化前后酸性環(huán)境下細(xì)菌生存能力的變化 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的大部分酸耐受試驗(yàn)都是在30或37 ℃下誘導(dǎo)酸耐受2 h，因此在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，本試驗(yàn)將腸炎沙門菌暴露于乙酸處理的pH4.0環(huán)境下，測(cè)定細(xì)菌在30、37 ℃以及模型優(yōu)化后的溫度環(huán)境下細(xì)菌在2 h內(nèi)生存能力的變化。

1.2.5 其他酸性壓力條件下模型優(yōu)化效果驗(yàn)證 其他培養(yǎng)條件相同的情況下，在30、37 ℃條件下誘導(dǎo)酸耐受2 h，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)模型優(yōu)化前后耐酸腸炎沙門菌耐酸基因轉(zhuǎn)錄情況，驗(yàn)證模型優(yōu)化對(duì)酸耐受的影響。同時(shí)將此模型應(yīng)用于甲酸、丙酸、正丁酸3種有機(jī)酸及無(wú)機(jī)酸磷酸環(huán)境下驗(yàn)證此模型對(duì)其他幾種酸性壓力是否有效。

1.2.5.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：采用傳統(tǒng)法提取細(xì)菌RNA，并使用NANODROP超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。使用前用去核酸水對(duì)超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行清洗，用DEPC水進(jìn)行校正調(diào)零。取1 μL RNA樣品點(diǎn)樣于超微量紫外分光光度計(jì)，直接讀數(shù)即可。選取OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0范圍內(nèi)樣品進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

在逆轉(zhuǎn)錄之前，先去除gDNA，以消除總RNA中g(shù)DNA的影響。分別加入5×gDNA Eraser Buffer，2.0 μL；gDNA Eraser，1.0 μL；RNA，5.0 μL；RNase Free ddH2O加至10 μL。反應(yīng)條件：42 ℃金屬浴2 min或者室溫下孵育30 min。取上述反應(yīng)液10 μL；加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL；RT Primer Mix 1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4.0 μL，RNase Free ddH2O 4.0 μL，總共20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存，反應(yīng)完成后，-20 ℃保存，用于下一步的試驗(yàn)。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：熒光定量PCR的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

基因Gene方向Direction引物序列Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductlengthgmK[26-27]ForwardprimerReserseprimer5'-TTGGCAGGGAGGCGTTT-3'5'-GCGCGAAGTGCCGTAGTAAT-3'101ompR[30]ForwardprimerReserseprimer5'-TGACCCGTGAATCTTTCCAT-3'5'-CCTTCGCCGTGACCATAA-3'126fur[31]ForwardprimerReserseprimer5'-ATGGGTGAAGAAATCGGTCT-3'5'-ATGGTCGTGATGATGCTGTT-3'135

以未做處理的標(biāo)準(zhǔn)菌cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)目的基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，點(diǎn)樣于10 g·L-1瓊脂糖凝膠孔中，120 V電泳20 min后，置于凝膠成像儀中觀察，并做好記錄。

用Easy Dilution對(duì)上述普通PCR的產(chǎn)物進(jìn)行稀釋。取10個(gè)離心管，分別加入45 μL Easy Dilution，取5 μL 上述普通PCR產(chǎn)物加入第一個(gè)離心管，吹打混勻以后再取5 μL混合液加入第二個(gè)離心管中，以此類推，直至第10個(gè)離心管。取后8個(gè)離心管作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，然后對(duì)目的基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，從而優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)的條件、獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.3 耐酸基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)耐酸基因ompR、fur進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系。以gmK基因作為內(nèi)參基因，每個(gè)

樣品設(shè)定3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)生物重復(fù)做兩個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用ΔΔCt法分析確定目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平= 2-ΔΔCt(式中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt測(cè)試樣品-ΔCt校準(zhǔn)樣品)。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.1.1 單因素預(yù)試驗(yàn) 分別以細(xì)菌培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)、母菌液添加量(1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%)、培養(yǎng)時(shí)間(3、4、5、6、7、8 h)作為影響因素，研究各單因素對(duì)細(xì)菌酸耐受情況的影響，結(jié)果如圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)所研究的所有變量均對(duì)細(xì)菌酸耐受產(chǎn)生影響，并且當(dāng)培養(yǎng)溫度為20 ℃、母菌液添加量為10%、培養(yǎng)時(shí)間為6 h時(shí)，腸炎沙門菌對(duì)pH 4.0最容易產(chǎn)生耐受。

圖1 培養(yǎng)溫度、時(shí)間、母菌液添加量對(duì)沙門菌耐酸性的影響Fig.1 The influence of incubation temperature, incubation time and microbial amount on acid resistance of Salmonella

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面法的Box-Behnken設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化和分析選定的因素：細(xì)菌培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、菌液添加量，分別記為A、B、C，在3個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化研究，以菌落數(shù)為響應(yīng)值，記為Y，建立數(shù)學(xué)模型。響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表2，Box-Behnken設(shè)計(jì)的獨(dú)立變量和響應(yīng)值見(jiàn)表3。

2.1.3 模型建立與方差分析 為了優(yōu)化3個(gè)獨(dú)立變量(細(xì)菌培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、菌液添加量)對(duì)酸性壓力條件下細(xì)菌菌落數(shù)的影響，采用3個(gè)因素和3個(gè)水平進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，通過(guò)Design Expert 8.0軟件采用多元回歸分析對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出以菌落數(shù)(Y)為響應(yīng)值，細(xì)菌培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、菌液添加量為變量真實(shí)值的二次多項(xiàng)式方程來(lái)描述酸性壓力條件下菌落數(shù)與變量之間關(guān)系：Y=0.39+0.018A+0.011B+0.013C-0.015AB+0.017AC-3.1×10-3BC-0.035A2-0.049B2-5.925×10-4C2，R2=0.953 7。模型的方差分析及失擬項(xiàng)見(jiàn)表4。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平

Table 2 Variables and levels in response surface design

因素Factor因素標(biāo)記Factorsign水平Level-101溫度/℃TemperatureA152025時(shí)間/hTimeB567菌液添加量/%AmountofbacteriaaddedC51015

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)的獨(dú)立變量和響應(yīng)值

Table 3 Box-Behnken design with independent variables and response values

試驗(yàn)編號(hào)Testnumber溫度/℃Temperature時(shí)間/hTime菌液添加量/%Amountofbacteriaadded菌落數(shù)/(109CFU·mL-1)Numberofcolonies1156150.34122206100.38143257100.32534207150.3510520750.34216205150.34127206100.38128256150.4001920550.319910155100.25351115650.339112206100.38511325650.329914206100.410015255100.329116206100.382117157100.3095

方差分析(ANOVA)用于分析模型方程的意義，其結(jié)果如表4所示。方差分析的兩個(gè)重要指標(biāo)是F值和P值，模型F值為16.04，說(shuō)明模型顯著，P<0.001同樣說(shuō)明該模型是顯著，同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)。因此，培養(yǎng)溫度、菌液添加量、培養(yǎng)時(shí)間是酸性壓力條件下菌落數(shù)的重要影響因素。

2.1.4 酸性模型優(yōu)化 應(yīng)用Design Expert 8.0 進(jìn)行二次多項(xiàng)式模型擬合作圖，通過(guò)3D響應(yīng)面圖和二維輪廓圖(圖2～4)反應(yīng)3個(gè)變量及其交互作用對(duì)酸性壓力條件下菌落數(shù)的影響。

通過(guò)軟件分析，誘導(dǎo)腸炎沙門菌耐酸性的最佳條件：培養(yǎng)溫度22.49 ℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h、菌液添加量15%。在此條件下，活菌菌落數(shù)達(dá)4.088×108CFU·mL-1。從二維圖可知，不同因素對(duì)誘導(dǎo)腸炎沙門菌耐酸性的影響大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度>菌液添加量>培養(yǎng)時(shí)間。說(shuō)明酸性壓力條件下，菌落數(shù)最依賴于培養(yǎng)溫度，其次是菌液添加量和培養(yǎng)時(shí)間。結(jié)合表4模型的方差分析以及圖2～4的三維圖可知，培養(yǎng)溫度和菌液添加量交互作用對(duì)酸性壓力條件下菌落數(shù)影響最大，其次是培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用，培養(yǎng)時(shí)間與菌液添加量交互作用對(duì)酸性壓力條件下菌落數(shù)影響最小，試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)菌培養(yǎng)溫度和菌液添加量二者交互作用對(duì)誘導(dǎo)腸炎沙門菌耐酸性的影響最大。

表4 模型的方差分析及失擬項(xiàng)

Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of the model and lack of fit

來(lái)源Source平方和Sumofsquare自由度Degreesoffreedom均方和MeansquareF值FvalueP值Pvalue模型Model0.02390.002516.040.0007A-溫度A-temperature0.002510.002515.740.0054B-時(shí)間B-time0.000910.00095.60.0498C-菌液添加量C-bacteriaaddeda-mount0.001310.001318.30.0236AB0.000910.00095.650.049AC0.001210.001167.330.0303BC0.0000410.000040.240.6371A20.005110.005132.230.0008B20.0110.0163.45<0.0001C20.000001510.00000150.00940.9257殘差Residual0.0011170.00016失擬項(xiàng)Miscalculationitem0.000530.000161.060.4594純誤差Pureerror0.0006240.00015總和Sum0.02416

圖2 細(xì)菌培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)沙門菌耐酸性的影響Fig.2 The influence of cultivate bacteria temperature and time on the acid resistance of Salmonella

圖3 細(xì)菌培養(yǎng)溫度與母菌液添加量對(duì)沙門菌耐酸性的影響Fig.3 The influence of cultivate bacteria temperature and microbial amount on the acid resistance of Salmonella

圖4 細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間與母菌液添加量對(duì)沙門菌耐酸性的影響Fig.4 The influence of cultivate bacteria time and microbial amount on the acid resistance of Salmonella

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用“2.1.4”試驗(yàn)中得到的最佳酸耐受誘導(dǎo)條件培養(yǎng)溫度22.49 ℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h、菌液添加量15%進(jìn)行誘導(dǎo)酸耐受重復(fù)試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的方便性，將最適培養(yǎng)溫度修正為22.5 ℃。按照修正后模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，優(yōu)化模型條件下耐酸細(xì)菌菌落數(shù)平均為0.396 6×109CFU·mL-1，符合度為97%。試驗(yàn)結(jié)果與應(yīng)用Design Expert 8.0 進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果接近，說(shuō)明優(yōu)化模型適用于誘導(dǎo)腸炎沙門菌的耐酸性。

2.2 模型優(yōu)化對(duì)腸炎沙門菌生存能力的影響

由圖5可知，3種模型條件均對(duì)腸炎沙門菌的生存能力影響較大，首先，在pH4.0條件下，2 h的時(shí)間內(nèi)，腸炎沙門菌的生存能力不斷下降，結(jié)合圖1可知，優(yōu)化溫度條件下，腸炎沙門菌生存能力下降最慢，并在適應(yīng)酸之后，生存能力再緩慢回升。對(duì)比3種生長(zhǎng)模型，可以推測(cè)，酸性壓力條件下，溫度越低，細(xì)菌生長(zhǎng)能力越強(qiáng)，并在優(yōu)化溫度條件下達(dá)到最強(qiáng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，在溫度較低條件下，腸炎沙門菌適應(yīng)酸的能力越強(qiáng)，37 ℃環(huán)境下，細(xì)菌適應(yīng)酸能力最弱。

圖5 不同模型條件下腸炎沙門菌的生存能力Fig.5 Survival rates of Salmonella enteritidis under different model conditions

2.3 模型優(yōu)化對(duì)耐酸性基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.3.1 PCR引物可行性驗(yàn)證結(jié)果 3對(duì)引物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增以后，其產(chǎn)物凝膠電泳所獲得的條帶如圖6所示。ompR基因與fur基因擴(kuò)增條帶大小與設(shè)計(jì)大小一致，將管家基因gmK的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并與GenBank的序列(登錄號(hào)：AF140283)進(jìn)行對(duì)比，保守區(qū)序列相似性為98.01%。

M. DL1000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M. DL1000 DNA marker圖6 3對(duì)引物擴(kuò)增基因的凝膠電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis results of three genes

2.3.2 熒光定量PCR結(jié)果

2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：熒光定量PCR擴(kuò)增獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，3個(gè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度(R2)均在0.99～1，擴(kuò)增效率(E)均在98%～105%，其中兩個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖7所示。

2.3.2.2 耐酸基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果：以未經(jīng)過(guò)酸處理的沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌(加入等量PBS)作為空白組對(duì)照，3種處理方式對(duì)沙門菌耐酸基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響如圖8所示。

圖7 gmK(A)、ompR(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of gmK(A), ompR(B)

*.P<0.05; **.P<0.01圖8 3種處理方式對(duì)沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌耐酸基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.8 Effect of three kinds of treatment methods on the Salmonella standard acid tolerance related genes

由圖8可知，優(yōu)化前的兩種方式對(duì)兩種酸耐受基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量雖然產(chǎn)生影響，但是影響很小，模型優(yōu)化后耐酸基因fur的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量是模型優(yōu)化前的1.4、1.12倍，ompR的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量是模型優(yōu)化前的1.40、1.13倍，并且相互之間具有極顯著差異(P<0.01)，因此可以驗(yàn)證模型優(yōu)化結(jié)果對(duì)乙酸耐受性產(chǎn)生最大影響。

2.3.2.3 優(yōu)化模型對(duì)其他酸性壓力環(huán)境下耐酸基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果: 由圖9可知，用甲酸、丙酸、正丁酸、磷酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至4.0，菌液添加量一樣的條件下，相比優(yōu)化前大部分研究酸耐受文獻(xiàn)常用的在37 ℃環(huán)境下恒溫誘導(dǎo)酸耐受2 h，優(yōu)化后在22.5 ℃誘導(dǎo)6 h耐酸基因fur的相對(duì)轉(zhuǎn)錄都有極顯著提高(P<0.01)。轉(zhuǎn)錄量升高最為明顯的為丙酸壓力環(huán)境下，fur相對(duì)轉(zhuǎn)錄升高2.04倍。

*.P<0.05; **.P<0.01圖9 兩種酸誘導(dǎo)模型對(duì)fur基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.9 Effects of two acid-induced models on the relative expression of fur gene

由圖10可知，用甲酸、丙酸、正丁酸、磷酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至4.0，在菌液添加量一樣的條件下，相比優(yōu)化前在37 ℃環(huán)境下恒溫誘導(dǎo)酸耐受2 h，優(yōu)化后在22.5 ℃誘導(dǎo)6 h耐酸基因ompR的相對(duì)轉(zhuǎn)錄同樣都有極顯著提高(P<0.01)。轉(zhuǎn)錄量升高最為明顯的同樣是丙酸壓力環(huán)境下，ompR相對(duì)轉(zhuǎn)錄升高2.42倍。

*.P<0.05; **.P<0.01圖10 兩種酸誘導(dǎo)模型對(duì)ompR基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.10 Effects of two acid-induced models on the relative expression of ompR gene

3 討 論

抗生素在為畜牧業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)，也因被濫用產(chǎn)生許多負(fù)面作用，因此，畜禽養(yǎng)殖各階段逐步應(yīng)用酸替代抗生素，以期能控制致病菌的傳播[32]。而酸作為防腐劑的成分之一在食品工業(yè)中應(yīng)用已有近百年歷史。研究表明，酸的使用可以有效減少一些食源性致病菌的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[33-34]。S. Bearson等[35]研究認(rèn)為，酸性環(huán)境中的微生物可以感受到環(huán)境的惡化，合成特殊的應(yīng)激蛋白。換而言之，在酸性環(huán)境中，不同的病原菌，以及一些進(jìn)化后的新病原菌，都會(huì)逐漸適應(yīng)酸性環(huán)境，并發(fā)展出在不同酸性環(huán)境中的不同生存方式[36]，這種適應(yīng)酸應(yīng)激的方式稱為酸耐受反應(yīng)。A. Lianou等使用威布爾模型分析在葡萄糖存在條件下使用30種人或牛來(lái)源的不同血清型沙門菌研究沙門菌菌株誘導(dǎo)性酸耐受反應(yīng)表型的變異性，結(jié)果表明這種酸耐受反應(yīng)在不同菌株中存在較大的變異性[9]。P. S. Malheiros等也報(bào)道了在腸桿菌的適應(yīng)性酸耐受反應(yīng)中的菌株差異[37]。而目前對(duì)于沙門菌耐酸性的研究幾乎沒(méi)有選取腸炎沙門菌作為研究對(duì)象，據(jù)報(bào)道，在歐盟(EU)沙門菌是引起食源性疾病的首要原因，截至2013年，腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌是從人類身上分離到的最常見(jiàn)的兩個(gè)血清型(分離率分別為39.5%和20.2%，N=73 627)[38-39]。腸炎沙門菌在臨床上具有重要地位，有必要對(duì)其酸耐受反應(yīng)進(jìn)行研究。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)乙酸處理，腸炎沙門菌酸耐受相關(guān)基因fur、ompR轉(zhuǎn)錄均極顯著升高，因此可知腸炎沙門菌能在酸性環(huán)境下適應(yīng)酸并產(chǎn)生酸耐受反應(yīng)。本研究將響應(yīng)面法應(yīng)用于腸炎沙門菌酸耐受條件的優(yōu)化，獲得較好的結(jié)果。通過(guò)條件優(yōu)化得出的最佳條件：培養(yǎng)溫度22.5 ℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h、菌液添加量15%，細(xì)菌菌落數(shù)平均為3.966×108CFU·mL-1，與模型預(yù)測(cè)的提取率誤差較小，說(shuō)明該條件參數(shù)是合理可靠的。

對(duì)比3種模型條件對(duì)腸炎沙門菌的生存能力影響，首先，在pH4.0條件下，2 h的時(shí)間內(nèi)，腸炎沙門菌的生存能力不斷下降，同時(shí)，由試驗(yàn)結(jié)果可知，溫度越低，腸炎沙門菌的生存能力下降越慢，優(yōu)化后的模型條件下，腸炎沙門菌的生存能力下降最慢，說(shuō)明在溫度較低條件下，腸炎沙門菌適應(yīng)酸的能力越強(qiáng)，37 ℃環(huán)境下，細(xì)菌適應(yīng)酸能力最弱。經(jīng)過(guò)酸處理后耐酸菌的fur和ompR相對(duì)轉(zhuǎn)錄均升高，相比已報(bào)道的常用于研究誘導(dǎo)酸耐受模型[10,13,17]，應(yīng)用優(yōu)化后的誘導(dǎo)酸耐受模型進(jìn)行誘導(dǎo)后酸耐受相關(guān)基因fur和ompR的相對(duì)轉(zhuǎn)錄極顯著升高(P<0.01)。換而言之，在優(yōu)化后的誘導(dǎo)酸耐受模型條件下腸炎沙門菌更易產(chǎn)生耐酸性。同時(shí)，本研究還將此模型應(yīng)用于其他常用酸甲酸、丙酸、正丁酸和磷酸誘導(dǎo)的酸耐受模型上，對(duì)比37 ℃環(huán)境下誘導(dǎo)酸耐受對(duì)fur和ompR基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果同樣驗(yàn)證了該模型更易誘導(dǎo)腸炎沙門菌產(chǎn)生耐酸性，提高腸炎沙門菌耐酸基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄。

4 結(jié) 論

成功建立腸炎沙門菌耐酸模型：培養(yǎng)溫度22.5 ℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h、菌液添加量15%，在此模型下，與已報(bào)道常用于進(jìn)行誘導(dǎo)酸耐受的2種模型進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)化模型條件下，腸炎沙門菌的生存能力下降最慢，說(shuō)明在溫度較低條件下，腸炎沙門菌適應(yīng)酸的能力越強(qiáng)。同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定耐酸基因fur和ompR相對(duì)轉(zhuǎn)錄的變化驗(yàn)證模型優(yōu)化結(jié)果，驗(yàn)證了該方法能合理地優(yōu)化細(xì)菌酸耐受誘導(dǎo)條件，并且，該方法對(duì)其他酸性壓力條件下誘導(dǎo)的酸耐受同樣有效。

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