吳靜波，南文金，黃健強(qiáng)，胡鴻惠，彭國(guó)良，彭 凌，董小英

(韶關(guān)學(xué)院粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，韶關(guān) 512005)

豬鏈球菌是造成生豬養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要病原之一，全球幾乎100%規(guī)模化豬場(chǎng)均有豬鏈球菌存在[1]。該菌可通過(guò)呼吸道相互傳播，主要引起敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等。同時(shí)豬鏈球菌也是一種人獸共患病病原，可通過(guò)接觸帶菌豬或豬肉產(chǎn)品感染人，引起敗血癥、腦膜炎，甚至休克樣綜合征，導(dǎo)致死亡[1]。盡管50年來(lái)人感染豬鏈球菌大多為職業(yè)接觸性的散發(fā)病例，比如養(yǎng)殖戶、獸醫(yī)、屠夫、食品加工者等職業(yè)人群[2]；但最近幾年人感染豬鏈球菌病例的數(shù)量不斷增加，并趨向于常規(guī)人群。在中國(guó)有過(guò)兩次豬鏈球菌2型的區(qū)域大流行，分別為1998年江蘇25人感染14人死亡和2005年四川215人感染38人死亡，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[2-4]。

豬鏈球菌為革蘭陽(yáng)性球菌，是豬的正常寄生菌，主要定植在豬的上呼吸道中，尤其是在扁桃體和鼻腔，也可定植于生殖器和消化道內(nèi)[5-6]。根據(jù)莢膜多糖的抗原性，將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型(1～34型及1/2型)，在所有血清型中1、2、1/2、7、9、14型為豬群中的主要致病血清型[7]，2、14型為人群中的主要致病血清型[1]。調(diào)查顯示不管是在人群還是豬群中，2型都是最為主要的致病菌，致病力和流行率都是最高的，占全球病例數(shù)的74.7%和27.9%，是疫情監(jiān)控和病原鑒定的首要檢測(cè)對(duì)象[1,3,8]。

目前細(xì)菌分離培養(yǎng)與血清學(xué)分型結(jié)合仍然是診斷豬鏈球菌的金標(biāo)準(zhǔn)[1,9]，但此方法耗時(shí)，靈敏度低，操作要求高，不利于推廣和疫情監(jiān)測(cè)[10-11]，另外血清學(xué)方法也無(wú)法檢測(cè)出無(wú)莢膜菌株和自凝菌株[12-15]。對(duì)此研究者建立了單個(gè)或多重PCR、MLST、熒光PCR等方法對(duì)豬鏈球菌保守基因或不同血清型特異的莢膜多糖基因進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序[10,13,16-24]，在基因水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)豬鏈球菌的鑒定與分型，彌補(bǔ)了血清學(xué)分型的不足，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。其中就包括多個(gè)豬鏈球菌通用型或2型的TaqMan熒光PCR方法，但這些方法都為單熒光PCR，無(wú)法實(shí)現(xiàn)單管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)豬鏈球菌和豬鏈球菌2型，增加了疫情監(jiān)測(cè)的工作量和成本。本研究采用TaqMan多重?zé)晒釶CR技術(shù)，以豬鏈球菌的保守基因gdh和2型特異性基因cps2J為靶基因設(shè)計(jì)兩個(gè)不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針，建立了SS通用型和2型特異性的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)與常規(guī)PCR對(duì)比，檢驗(yàn)其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，力求建立一個(gè)快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的雙重檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株

所使用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存，包括9株經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)血清和血清型特異性PCR確定的豬鏈球菌1、1/2、2、3、4、7、9、14、16型；11株陰性對(duì)照菌，分別為大腸埃希菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎鏈球菌(ATCC 49619)、化膿性鏈球菌(ATCC 19615)、糞腸球菌(ATCC 29212)、乙型溶血性鏈球菌(ATCC 21059)、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、敗血波氏桿菌、豬鼻支原體(CVCC 361)、馬鏈球菌獸疫亞種(CVCC 573)。

1.2 引物探針設(shè)計(jì)

gdh基因是豬鏈球菌的保守基因[25-26]，在不同血清型中的一致性達(dá)到96%；cps2J是豬鏈球菌2型的型特異性基因[27]，在血清型內(nèi)較為保守，一致性達(dá)到99%。我們以豬鏈球菌2型參考株P(guān)1/2的基因組為參考序列(GenBank登錄號(hào):AM946016)，根據(jù)gdh和cps2J基因的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物和探針，要求兩靶基因的引物及探針之間無(wú)非特異性反應(yīng)，序列如表1所示。使用FAM熒光素標(biāo)記gdh檢測(cè)探針，用于豬鏈球菌通用型的檢測(cè)；使用HEX熒光素標(biāo)記cps2J探針，用于豬鏈球菌2型的檢測(cè)。使用MAGA 5.1和Oligo 7進(jìn)行多重比對(duì)和引物探針設(shè)計(jì)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3 優(yōu)化雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件

試驗(yàn)使用ABI 7500熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增和分析，以Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(RR390，TaKaRa,中國(guó))作為反應(yīng)緩沖液。首先在緩沖液推薦的反應(yīng)體系下進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，設(shè)置6個(gè)退火溫度，分別為50、52、54、56、58、60 ℃，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min進(jìn)行預(yù)變性及啟動(dòng)Taq酶，然后95 ℃ 15 s變性，50～60 ℃退火延伸30 s并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。在確定退火溫度后則對(duì)引物和探針?lè)磻?yīng)濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)3×3矩陣表(如表2)分9個(gè)組，包括3個(gè)引物濃度(200、300、400 nmol·L-1)和3個(gè)探針濃度(100、150、200 nmol·L-1)。反應(yīng)使用25 μL反應(yīng)體系，包括12.5 μL Premix ExTaqbuffer(2×)，0.5 μL的引物(10 μmol·L-1)和探針(5 μmol·L-1)，1 μL的豬鏈球菌2型基因組DNA樣品，0.25 μL ROX Reference Dye(50×)，無(wú)RNA酶水補(bǔ)至25 μL。

表1 引物和探針序列

Table 1 Sequences of primes and probes

名稱Name序列(5'-3')aSequence(5'-3')a基因組中位置bGenomepositionb產(chǎn)物大小/bpAmpliconsizeGDH-FGAGCTCTTCTCTACACTTGAGCC240807—240829114GDH-R/SRcCCATGGAACACGGAAGCTG240716—240734GDH-PFAM-TTGAAGCACACCCAGAATACATCGAAGAA-TAMRA240773—240801214GDH-SFcGGAATTCCATATGTCAAATGCC240908—240919CPS2J-FGATAGATGACGGTTCTTCAGATTCAT563492—56351793CPS2J-RCCATTTGGTAACCGGAAAAGTT563563—563584CPS2J-PdHEX-TCTACCATCTTGCTCTGCGTATTCCA-TAMRA563533—563558CPS2J-SFcAGGAATTCCATATGGAAAAAGTCAGCATTATTG563385—5634061019CPS2J-SRcCCGCTCGAGTTAATCATTATTTTTTTCTTCCC564361—564383SS2-FeGATTTGTCGGGAGGGTTACTTG450SS2-ReTAAATAATATGCCACTGTAGCGTCTCSSall-FeTTCTGCAGCGTATTCTGTCAAACG695SSall-ReTGTTCCATGGACAGATAAAGATGG

a. 下劃線標(biāo)記的為限制性酶切位點(diǎn)；b. 引物探針?biāo)诘幕蚪M位置是參照豬鏈球菌2型P1/7株的序列，其中g(shù)dh的引物探針序列為基因組的反向序列；c. SF和SR為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的普通PCR引物，其中GDH-R/SR同時(shí)應(yīng)用于雙重?zé)晒舛縋CR和普通PCR中；d. CPS2J-P為下游探針；e. 引物序列參考文獻(xiàn)[17]

a. The underscores is the restriction site;b. Genome positions were numbered according to reference sequence AM946016.1 (Serotype 2),gdhsequence is a reverse sequence;c. SF and SR were primers of conventional PCR for standard DNA, GDH-R/SR was used to duplex Real-Time PCR and conventional PCR;d. CPS2J-P is a reverse probe;e. Reference from relative reference[17]

表2 引物及探針濃度的矩陣分組情況

Table 2 The groups of difference concentration of primer and probe

探針濃度/(nmol·L-1)Probeconcentration引物濃度/(nmol·L-1)Primerconcentration200300400100A1A2A3150B1B2B3200C1C2C3

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

為繪制雙重?zé)晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們?cè)跓晒舛縋CR引物兩側(cè)又設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品DNA，序列為表1所示的GDH-SF、GDH-SR(與熒光定量PCR引物相同)、CPS2J-SF、CPS2J-SR，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為214和1 019 bp。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后用凝膠回收試劑盒(cat#9762，TaKaRa，中國(guó))回收，與pMD-18T(TaKaRa，中國(guó))載體連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)(TaKaRa，中國(guó))培養(yǎng)過(guò)夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒純化pMD-18T-GDH和pMD-18T-CPS2J質(zhì)粒，經(jīng)NanoDrop ND-2000C(Thermo，美國(guó))測(cè)得濃度后計(jì)算質(zhì)粒原始拷貝數(shù)，然后用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(TaKaRa，中國(guó))將兩質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍稀釋為4×108～4×101copies·μL-18個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率。

1.5 特異性、靈敏度、重復(fù)性

用我們建立的方法對(duì)“1.1”所述的9株豬鏈球菌和11株陰性菌株的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法能否在準(zhǔn)確鑒定出豬鏈球菌的同時(shí)不對(duì)陰性對(duì)照菌產(chǎn)生非特異性反應(yīng)；并驗(yàn)證豬鏈球菌2型的特異性引物和探針是否對(duì)其他血清型的豬鏈球菌不產(chǎn)生非特異反應(yīng)。

對(duì)兩個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至40、20、10、5、2.5 copies·μL-15個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)復(fù)孔，然后用我們最優(yōu)擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定最低檢出極限。

使用“1.4”稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品4×107～4×103copies·μL-15個(gè)梯度進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，每個(gè)梯度3個(gè)復(fù)孔，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次檢測(cè)；計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)，以測(cè)定雙重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性。

1.6 臨床樣品檢測(cè)

用基因組DNA提取試劑盒(cat#9765，TaKaRa，中國(guó))對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的67份呼吸道疾病和關(guān)節(jié)炎的臨床病料(包括鼻拭子、關(guān)節(jié)液、扁桃體、肺等)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取；用我們建立的雙重?zé)晒舛縋CR和已公布的常規(guī)PCR方法[17]平行檢測(cè)獲得的DNA模板。兩方法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：熒光定量PCR以出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性，并根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品模板拷貝數(shù)；普通PCR以電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)目的片段為陽(yáng)性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，使用SPSS軟件分析兩種PCR方法的符合率和一致性(kappa系數(shù))；以普通PCR結(jié)果為參照，繪

制ROC曲線，計(jì)算雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)的最佳陽(yáng)性閾值。

2 結(jié) 果

2.1 雙重?zé)晒舛縋CR最優(yōu)反應(yīng)條件

在對(duì)同一個(gè)樣品的重復(fù)檢測(cè)中，6個(gè)退火溫度的Ct值、擴(kuò)增曲線斜率和線型均沒(méi)有明顯的差異，但56 ℃下的結(jié)果稍好于其他退火溫度(數(shù)據(jù)未顯示)；9個(gè)引物和探針濃度組合的雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增結(jié)果如圖1示，結(jié)合兩個(gè)靶基因的擴(kuò)增曲線，可以看出C組的擴(kuò)增曲線比其他兩組具有更大的斜率和更小的Ct值，而C1又稍優(yōu)于C2和C3組。所以雙重?zé)晒舛縋CR的最優(yōu)退火溫度為56 ℃，最優(yōu)引物和探針濃度為200 nmol·L-1。

字母A、B、C表示探針濃度100、150、200 nmol·L-1，數(shù)字1、2、3表示引物濃度200、300、400 nmol·L-1，NC為陰性對(duì)照In the group name, A, B, C represent 100, 150, 200 nmol·L-1 probe concentration, respectively; and number 1, 2, 3 represent 200, 300, 400 nmol·L-1 primers concentration, respectively. NC represent negative control圖1 9個(gè)引物和探針濃度優(yōu)化組合的擴(kuò)增曲線圖Fig.1 Amplification curves of duplex real-time PCR for S. suis and S. suis 2 at 9 concentration groups of primer and probe

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在最優(yōu)雙重?zé)晒舛縋CR條件下分別對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-18T-GDH和pMD-18T-CPS2J的檢測(cè)，均只單獨(dú)出現(xiàn)FAM和HEX熒光曲線，即相互之間不存在非特異擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。8個(gè)濃度梯度的Ct值與對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)的lg值呈現(xiàn)線性關(guān)系，且線性范圍極寬；豬鏈球菌和豬鏈球菌2型的線性公式分別為y=-3.291 1x+41.154和y=-3.342 4x+41.562(y為Ct值，x為lg原始拷貝數(shù))，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 4和0.999 3，擴(kuò)增效率分別為101.303%和99.157%。

2.3 特異性、靈敏度、重復(fù)性

雙重?zé)晒舛縋CR方法在檢測(cè)9株豬鏈球菌(1、2、1/2、3、4、7、9、14、16型)基因組DNA時(shí)FAM熒光(gdh基因)均為陽(yáng)性，但只有檢測(cè)2和1/2型時(shí)HEX熒光(cps2J基因)才為陽(yáng)性，而在對(duì)11株陰性對(duì)照菌的檢測(cè)中雙熒光都為陰性(結(jié)果未顯示)；表明這個(gè)方法可特異性鑒別豬鏈球菌和豬鏈球菌2型。

測(cè)定雙重?zé)晒舛縋CR方法檢測(cè)極限的結(jié)果如圖3所示，在最優(yōu)反應(yīng)條件下對(duì)5 copies·μL-1以上模板量的擴(kuò)增均能出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，即檢測(cè)極限值為5拷貝數(shù)。但是在低于10 copies·μL-1時(shí)試驗(yàn)的穩(wěn)定性會(huì)下降(結(jié)果未顯示)。

圖2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA的擴(kuò)增曲線圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Duplex RT-PCR amplification plots and standard curves of single plasmid standard DNA for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

40、20、10、5、2.5表示質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)(copies·μL-1)40, 20, 10, 5, 2.5 is the copy number of plasmid standard DNA (copies·μL-1)圖3 雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)低濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖Fig.3 The detection limits of duplex RT-PCR for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

我們將3次不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果繪制成誤差限圖(圖4)，顯示5個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差都在0.06～0.24，3次檢測(cè)組內(nèi)變異系數(shù)在0.24%～1.19%間，組間的變異系數(shù)在0.39%～0.97%，穩(wěn)定性極高。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)67份臨床樣品進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR和常規(guī)PCR檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，雙重?zé)晒舛縋CR總共檢出53例(79.1%)豬鏈球菌通用型陽(yáng)性樣品和24例(35.8%)豬鏈球菌2型陽(yáng)性樣品；并且豬鏈球菌2型陽(yáng)性樣品的通用型檢測(cè)也都為陽(yáng)性，占豬鏈球菌陽(yáng)性樣品的45.3%。對(duì)兩PCR方法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，顯示定量結(jié)果中模板量大于等于100拷貝數(shù)的樣品普通PCR結(jié)果都為陽(yáng)性，模板量為0拷貝數(shù)的樣品普通PCR都為陰性，兩個(gè)范圍內(nèi)兩方法的結(jié)果符合率為100%。而定量結(jié)果為1～100拷貝數(shù)的樣品中，兩方法通用型和2型的符合率分別為54.5%和50%，其中5例通用型(樣品和拷貝數(shù)分別為鼻拭子7、14、15號(hào)：53、18、73，關(guān)節(jié)液1號(hào)：10，肺組織5號(hào)：66)和7例2型(樣品和拷貝數(shù)分別為鼻拭子3、6、7、8、15號(hào)：7、24、13、13、77，關(guān)節(jié)液1號(hào)：9，肺組織5號(hào)：63)樣品普通PCR為陰性，分別占熒光定量PCR通用型和2型陽(yáng)性樣品的9.4%和29.2%，另外6例通用型和7例2型樣品普通PCR為陽(yáng)性，其中最低拷貝數(shù)為通用型的35和2型的19。綜合統(tǒng)計(jì)分析顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法與通用型和2型普通PCR方法的符合率分別為92.5%和89.6%，kappa值分別為0.800和0.757，具有較高的一致性。以常規(guī)PCR結(jié)果為參考繪制ROC曲線(圖5)，顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法通用型和2型的曲線下面積分別為0.966(P<0.001)和0.985(P<0.001)，檢測(cè)Ct值最佳的陽(yáng)性閾值分別為35和38；在這個(gè)閾值下，雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)豬鏈球菌通用型檢測(cè)敏感度和特異度分別為89.6%和94.7%，對(duì)豬鏈球菌2型的敏感度和特異度分別為100%和94%(箭頭所指)。

右上角表格為各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品3次重復(fù)檢測(cè)的批內(nèi)和批間變異系數(shù)Intra-and inter-assay CV of three repeated detection for different concentration plasmid was shown in the table of the top right corner圖4 雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)所得Ct值的誤差限圖Fig.4 The error bar of repeatability assay for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

表3 雙重?zé)晒舛縋CR與常規(guī)PCR對(duì)67份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table 3 Results of duplex real-time PCR and conventional PCR for clinical samples

熒光定量PCRRT-PCR普通PCRConventionalPCR豬鏈球菌S.suis豬鏈球菌2型S.suistype2樣品類型Sampletype模板量(拷貝數(shù)/反應(yīng))Thequantityoftemplate(copies/reaction)+-+-鼻拭子Nasalswab≥100100001～100231500009關(guān)節(jié)液Articularfluid≥10010001～100111100203扁桃體Tonsil≥10050301～100002000000肺組織Lungtissue≥100260701～10031310012031總計(jì)Total≥1004201001～10065770014043

以熒光定量PCR檢測(cè)Ct值為檢驗(yàn)變量，常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果為狀態(tài)變量繪制ROC曲線。AUV表示曲線下面積，大于9時(shí)說(shuō)明檢測(cè)方法具有很高的診斷價(jià)值，P<0.001說(shuō)明診斷成立。最佳閾值是采用曲線上Youden指數(shù)最大點(diǎn)(Youden指數(shù)=敏感度+特異度-1)，圖上箭頭所指點(diǎn)The Ct value of duplex Real-Time PCR was test variable, Ct value of conventional PCR was state variable, ROC was drawn according to them. AUV mean area under curve.Detection prompted high diagnostic value when AUV was above 9, P<0.001 indicated diagnosis was established.The best positive threshold was Youden index (specificity+sensitivity-1) maximum points on curve, as the arrow in Figure 5圖5 以普通PCR檢測(cè)結(jié)果為參照繪制雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)臨床樣品結(jié)果的ROC曲線Fig.5 The receiver operating characteristic curve of duplex real-time PCR detection results for clinical samples which reference to conventional PCR

3 討 論

豬鏈球菌是豬上呼吸道系統(tǒng)中的正常寄生菌，其致病性的劃分比較模糊，部分菌株感染不引起臨床癥狀，或者輕微的發(fā)熱或敗血癥；但另外一些毒株可侵入腦、心、肺等主要器官，引發(fā)大量的炎癥反應(yīng)甚至休克性死亡[28]。現(xiàn)有證據(jù)表明，1～9和14型對(duì)豬具有致病性[3]，而2、4、5、14、16、21、24型可感染人類引起臨床癥狀[1]；其中豬鏈球菌2型是毒力最強(qiáng)，并且分離頻率最高的致病株，占全球報(bào)道的豬和人臨床病例數(shù)的27.9%和74.7%[1, 3, 8]，在北美、南美、歐洲、亞洲、澳大利亞等地區(qū)都是流行率最高的血清型[1,11-12, 29-32]。在我們的臨床樣品調(diào)查中也顯示豬鏈球菌2型占豬鏈球菌陽(yáng)性樣品的45.3%，比例較高。所以在豬鏈球菌的疫情監(jiān)測(cè)中，豬鏈球菌2型應(yīng)設(shè)為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象。

豬鏈球菌病的初步診斷一般是根據(jù)臨床癥狀、接觸史和可視病理變化，確診需要通過(guò)分離鑒定出病原菌。細(xì)菌分離培養(yǎng)與血清型分型是目前全球?qū)嶒?yàn)室普遍使用的診斷方法，其可靠性已得到研究者的認(rèn)可；但像大部分細(xì)菌一樣，豬鏈球菌的分離培養(yǎng)同樣存在靈敏度低、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、操作要求高等缺點(diǎn)，所以越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注豬鏈球菌的基因分型鑒定。包括針對(duì)型特異性的莢膜多糖基因序列設(shè)計(jì)分型PCR，這部分研究大多集中在主要致病菌上，但最近有學(xué)者針對(duì)33個(gè)血清型(不包括32和34型)的cps基因設(shè)計(jì)了多個(gè)多重PCR[16,18]，建立全套的基因分型方法；當(dāng)然現(xiàn)在使用最多的還是針對(duì)豬鏈球菌多個(gè)保守基因的MLST方法[24]，此方法主要檢測(cè)cpn60、dpr、recA、aroA、thrA、gki、mutS等7個(gè)保守基因，根據(jù)這7個(gè)基因的基因型進(jìn)行編碼確定豬鏈球菌的血清型(ST)，研究者還收集這些數(shù)據(jù)建立了MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，以方便豬鏈球菌的全球流行和分布情況的調(diào)查。

不過(guò)這兩個(gè)基因分型方法都比較費(fèi)時(shí)費(fèi)錢(qián)，而且交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)大，只能針對(duì)少量樣品；而我們建立的雙熒光定量PCR方法可以在1.5 h內(nèi)完成對(duì)大量樣品的處理和檢測(cè)，全程閉管操作，并在監(jiān)測(cè)豬鏈球菌通用型的同時(shí)可以完成對(duì)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象豬鏈球菌2型的篩選，與其他單熒光檢測(cè)方法相比更省錢(qián)省時(shí)；而且檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR方法的符合率達(dá)到92.5%和89.6%，kappa值達(dá)到0.800和0.757，模板在普通PCR靈敏度范圍內(nèi)的樣品兩方法檢測(cè)結(jié)果符合率甚至達(dá)到100%，具有極高的一致性。當(dāng)然，也和其他PCR方法一樣，我們的方法無(wú)法區(qū)分2型和1/2嵌合型，因?yàn)檫@兩種血清型的CPS基因非常相似，目前只能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行區(qū)分[33-34]。

在這次研究中，我們首先確定了雙重?zé)晒舛縋CR的最優(yōu)反應(yīng)條件，并構(gòu)建了兩個(gè)靶基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA；隨后在最優(yōu)條件下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行檢測(cè)并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示兩個(gè)靶基因的檢測(cè)結(jié)果和原始模板量都具有極高的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均可達(dá)到0.999，擴(kuò)增效率可達(dá)100%左右；并在多次的重復(fù)檢測(cè)中保持著高度的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分別低于0.24和1.19%；以細(xì)菌基因組DNA代替質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板的檢測(cè)結(jié)果同樣可保持在這個(gè)水平(數(shù)據(jù)未顯示)。

雖然我們無(wú)法收集齊35個(gè)豬鏈球菌血清型，但我們對(duì)主要的致病性血清型特別是2型進(jìn)行了檢測(cè)，顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法可特異性識(shí)別豬鏈球菌和豬鏈球菌2型，兩靶基因之間無(wú)交叉反應(yīng)，并對(duì)其他鏈球菌或呼吸系統(tǒng)細(xì)菌無(wú)非特異性反應(yīng)。在保持高特異性的同時(shí)，本方法的檢測(cè)極限可達(dá)到5 拷貝數(shù)，遠(yuǎn)低于常規(guī)PCR方法，這也使得在對(duì)臨床樣品的檢測(cè)中，雙重?zé)晒舛縋CR具有更高的檢出率。不過(guò)為了保證臨床應(yīng)用的特異性，我們以普通PCR方法為參照繪制ROC曲線，顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法的曲線下面積達(dá)到0.966(P<0.001)和0.985(P<0.001)，說(shuō)明本方法具有很高的診斷價(jià)值；在最佳閾值下，雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)豬鏈球菌的靈敏度和特異度達(dá)到89.6%和94.7%，檢測(cè)豬鏈球菌2型的靈敏度和特異度達(dá)到100%和94%，基本滿足臨床樣品檢測(cè)對(duì)靈敏度和特異度的要求。

成功建立了一種靈敏、特異和穩(wěn)定的雙重?zé)晒舛縋CR方法，可同時(shí)及快速診斷豬鏈球菌和2型豬鏈球菌，非常適合大量臨床樣品的檢測(cè)。但我們的研究也顯示，在拷貝數(shù)低于普通PCR靈敏度的模板樣品中，兩方法的符合率只有54.5%和50%，這可能與普通PCR靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性有關(guān)，但也不能排除熒光定量PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性可能。要解決這一問(wèn)題需要我們?cè)谙乱徊降难芯恐惺占嗟呐R床樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，并引入第三種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，探求熒光定量PCR方法在臨床應(yīng)用中Ct值的最佳陽(yáng)性閾值，以獲得最高靈敏度及特異度的平衡點(diǎn)。

4 結(jié) 論

成功建立靈敏、特異和穩(wěn)定的雙重?zé)晒舛縋CR方法，實(shí)現(xiàn)了豬鏈球菌和2型豬鏈球菌同時(shí)及快速診斷，此方法非常適合大量臨床樣品的檢測(cè)，可應(yīng)用于臨床診斷和疫情監(jiān)控，為診斷和防控豬鏈球菌病提供技術(shù)支持。

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