齊興財，秦曉東，甘曉麗，張淑敏，馬友記，李志勇*

(1. 甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2. 中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒感染引起(foot-and-mouth disease virus， FMDV)一種急性、高度傳染性的偶蹄類動物疫病[1-3]。FMDV易染動物包括牛、豬、綿羊、山羊和超過70種的野生動物物種[4]，嚴重妨礙了畜牧業(yè)健康發(fā)展[5]。目前，疫苗接種被廣泛用于預防FMDV感染，但由于該病毒有七個血清型，在幾個血清型之間缺乏交叉保護，血清型相同的不同毒株也可能沒有相互的保護作用[6]，還沒有其他有效的方法來阻止口蹄疫的流行[7]。因此應該加大力度研究防控該病。

自從RNAi技術被發(fā)明以來[8]，RNAi技術被廣泛的應用于抗病育種研究并且在抗病毒領域的研究中有了重大的突破，有望成為疾病預防的一種新型手段[9-11]。研究表明，利用RNAi技術靶向口蹄疫病毒的VP1、3D蛋白基因可以有效抑制FMDV在細胞內的復制，并且成功地生產了具有抗口蹄疫病毒的轉基因動物[12-14]。目前利用RNAi技術靶向口蹄疫病毒的3C基因的研究比較少，本研究針對ON口蹄疫病毒的VP1、3C、3D基因，構建shRNA重組表達質粒，在細胞水平上挑選出能夠高效抑制ON 口蹄疫病毒的干擾片段，并成功制備含有慢病毒干擾載體的慢病毒，為后續(xù)抗口蹄疫病毒的轉基因羊生產培育奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細胞和載體 ON 口蹄疫毒株由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所保存； DH5α感受態(tài)細胞購自全式金生物技術有限公司；倉鼠腎細胞BHK21、人腎上皮細胞293T、RNAi表達載體PLKO.1-TRC、慢病毒包裝質粒pMD2.G和psPAX2均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清均購自GIBCO公司；嘌呤霉素、Lipofectamine 2000 Transfection Reagent脂質體轉染試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、RNA提取試劑Trizol均購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；AgeⅠ、EcoRⅠ、NcoⅠ、T4DNA 連接酶、DNA Ladder Marker等常用試劑購自從大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據siRNA的設計原則和引物設計的方法，通過Thermofisher在線輔助設計工具，合成shRNA對應的DNA序列(表1)。這些序列由深圳華大基因有限公司合成。

1.2.2 構建重組表達質粒 根據PLKO.1-TRC的說明書進行，將合成的正義鏈和反義鏈DNA片段用去離子水溶解，終濃度為20 μmol·L-1，然后各取5 μL PCR儀上退火形成雙鏈。對PLKO.1-TRC質粒載體經AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后得到7 kb的片段膠回收純化，然后與退火生成的雙鏈小片段連接，分別命名為PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、 PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1、PLKO.1-3D-2；連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性菌落，提取質粒經EcoRⅠ和NcoⅠ酶切鑒定，并送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，鑒定重組表達質粒是否構建成功。

1.2.3 病毒的復制和TCID50的測定 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對BHK21細胞傳代培養(yǎng)，至生長狀態(tài)良好時棄掉培養(yǎng)基，加入100 μL的ON 口蹄疫病毒與2 mL的DMEM 培養(yǎng)1 h后，換液由含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞病變至80%左右收集病毒液，-80 ℃反復凍融3次并離心，收集上清。正常傳代培養(yǎng)BHK21細胞至生長狀態(tài)良好時，將細胞轉移至96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至90%左右，將病毒懸液進行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)，每孔加入100 μL稀釋好的病毒液，72 h后記錄不同梯度出現(xiàn)的細胞病變孔數(shù)，然后按照Reed-Muench方法計算病毒的TCID50[15]。

表1 合成shRNA所對應的DNA序列

Table 1 Synthesized DNA sequence correlated to shRNA

shRNA引物名稱NameofshRNAprimershRNA序列(5'-3')SequencesofshRNA(5'-3')VP1-1F:5'CCGGGACAACACTACCAACCCAACACTCGAGTGTTGGGTTGGTAGTGTTGTCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGACAACACTACCAACCCAACACTCGAGTGTTGGGTTGGTAGTGTTGTC3'VP1-2F:5'CCGGGGCAACTCGTGTGACTGAACTCTCGAGAGTTCAGTCACACGAGTTGCCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGGCAACTCGTGTGACTGAACTCTCGAGAGTTCAGTCACACGAGTTGCC3'3C-1F:5'CCGGGCGAAGCCCTTACTTACAAGGCTCGAGCCTTGTAAGTAAGGGCTTCGCTTTTTG3R:5'AATTCAAAAAGCGAAGCCCTTACTTACAAGGCTCGAGCCTTGTAAGTAAGGGCTTCGC3'3C-2F:5'CCGGGGATACTGTTCGTGCGTTTCCCTCGAGGGAAACGCACGAACAGTATCCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGGATACTGTTCGTGCGTTTCCCTCGAGGGAAACGCACGAACAGTATCC3'3D-1F:5'CCGGGCAAAGATTTGGCACACATTTCTCGAGAAATGTGTGCCAAATCTTTGCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGCAAAGATTTGGCACACATTTCTCGAGAAATGTGTGCCAAATCTTTGC3'3D-2F:5'CCGGGGACCATACAGGAGAAGTTGACTCGAGTCAACTTCTCCTGTATGGTCCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGGACCATACAGGAGAAGTTGACTCGAGTCAACTTCTCCTGTATGGTCC3'

1.2.4 重組表達質粒分別轉染BHK21細胞后接毒并提取總的RNA 正常傳代培養(yǎng)BHK21細胞至生長狀態(tài)良好時，將細胞轉入6孔板中，待細胞長至70%左右，按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent脂質體轉染說明書，將重組質粒PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1 和PLKO.1-3D-2分別轉入BHK21細胞中，轉染48 h后，每孔加入200個TCID50的ON 口蹄疫病毒。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集細胞毒液，采用Trizol法提取BHK21細胞的總RNA，按照說明書方法操作提取RNA。將RNA保存至-80 ℃待用。

1.2.5 Real-time PCR 檢測細胞內病毒RNA 選擇FMDV基因組中3D基因的一段保守序列作為標準品序列設計引物和探針。序列如下：F:5′-ACTGGGTTTTAYAAACCTGTGATG-3′，R:5′-TCAACTTCTCCTGKATGGTCCCA-3′，探針5′-ATCCTCTCCTTTGCACGC-3′，其中標準品序列全長130 bp[16]，然后建立標準曲線。將保存至-80 ℃的RNA取出，根據SuperScript Ⅲ Platinum one-Step Quantitative RT-PCR System 說明書操作。反應體系如下:2×ReactionMix 12.5 μL，50 nmol·L-1ROX Reference Dye，250 nmol·L-1探針，上、下游引物500 nmol·L-1，1 μL 模板，最終用 RNase-free water 加至 25 μL。qRT-PCR反應條件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。最后進行數(shù)據分析。

1.2.6 含重組質粒的細胞測定病毒TCID50正常傳代培養(yǎng)BHK21細胞至生長狀態(tài)良好時，將細胞轉入6孔板中，待細胞長至70%左右，按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent脂質體轉染說明書，將重組質粒PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1 和PLKO.1-3D-2分別轉入BHK21細胞中，轉染48 h后，將含有重組質粒的細胞分別轉移至96孔板，待細胞長至90%左右，將病毒懸液進行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)，每孔加入100 μL稀釋好的毒液，72 h后記錄不同梯度出現(xiàn)的細胞病變孔數(shù)，然后按照Reed-Muench方法計算病毒的TCID50。最后進行數(shù)據分析。

1.2.7 慢病毒的制備和穩(wěn)定細胞系的篩選 正常傳代培養(yǎng)293T至細胞生長狀態(tài)良好時，將抑制病毒復制效果比較好的PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3D-1質粒分別與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G用FuGENE?Transfection Reagent共轉染于293T細胞，分別于36、60 h后收集細胞液，得到慢病毒。使用慢病毒感染BHK21細胞48 h后，用5 μg·mL-1的嘌呤霉素篩選細胞，鑒定慢病毒是否制備成功并且得到穩(wěn)定的細胞系。

1.2.8 Real-time PCR 檢測慢病毒干擾載體對FMDV抑制效率 對穩(wěn)定篩選的細胞傳代培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)良好時，將細胞轉入6孔板中，待細胞長至70%左右，每孔加入200個TCID50的ON 口蹄疫病毒。收集培養(yǎng)12、18、24 h后的細胞毒液，采用Trizol法提取BHK21細胞的總RNA并使用Real-time PCR 檢測細胞內病毒RNA。最后進行數(shù)據分析。

1.2.9 含慢病毒干擾載體的細胞測定病毒的TCID50對穩(wěn)定篩選的細胞傳代培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)良好時，將細胞轉移至96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至90%左右，將病毒懸液進行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)，每孔加入100 μL稀釋好的病毒液，72 h后記錄不同梯度出現(xiàn)的細胞病變孔數(shù)，然后按照Reed-Muench方法計算病毒的TCID50。

2 結 果

2.1 重組表達質粒的鑒定

連接轉化后，提取轉化菌質粒DNA，經EcoRⅠ和NcoⅠ酶切鑒定，得到5和2 kb的兩條帶(圖1)。對重組表達質粒進行測序，結果證明成功構建了重組質粒，分別命名為PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1、PLKO.1-3D-2。

M. DL5000相對分子質量標準； 1. PLKO.1-VP1-1； 2.PLKO.1-VP1-2；3.PLKO.1-3C-1；4.PLKO.1-3C-2；5. PLKO.1-3D-1； 6.PLKO.1-3D-2重組質粒雙酶切鑒定M.DL5000 marker；1. PLKO.1-VP1-1；2.PLKO.1-VP1-2；3.PLKO.1-3C-1；4.PLKO.1-3C-2；5. PLKO.1-3D-1；6.PLKO.1-3D-2 double enzyme identification of recombinant plasmid圖1 重組質粒雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme identification of recombinant plasmid

2.2 病毒TCID50的測定和RT-PCR 檢測

使用正常的BHK21細胞測定病毒的TCID50為10-5.875·100 μL-1。將標準品進行10倍梯度稀釋，并進行RT-PCR擴增。擴增結束后，根據起始的濃度值和循環(huán)CT值繪制標準曲線(圖2A)，根據標準曲線可得知，擴增循環(huán)CT值與模板拷貝數(shù)的對數(shù)值呈良好的線性關系。相關系數(shù)R2=0.999，表明檢測數(shù)據比較可靠。將含有重組質粒的細胞，每孔加入200 個TCID50的ON 口蹄疫病毒，12 h后收集細胞毒液，提取總RNA進行RT-PCR檢測，并進行數(shù)據分析。重組質粒PLKO.1-VP1-1的抑制效率為86.06%、PLKO.1-VP1-2的抑制效率為93.2%、PLKO.1-3C-1的抑制效率為71.5%、PLKO.1-3C-2的抑制效率為84.1%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為90.8%、PLKO.1-3D-2的抑制效率為87.3%(圖2B)。根據數(shù)據分析結果表明重組質?？捎行У匾种艶MDV的復制。

2.3 重組質粒轉染BHK21細胞后病毒TCID50的測定

使用正常BHK21細胞和分別含有重組質粒的細胞測定病毒的TCID50，得到對照細胞測定病毒的TCID50為10-5.875·100 μL-1，含有重組質粒PLKO.1-VP1-1的細胞測定病毒的TCID50為10-5.041·100 μL-1、含有重組質粒PLKO.1-VP1-2的細胞測定病毒的TCID50為10-4.725·100 μL-1、含有重組質粒PLKO.1-3C-1的細胞測定病毒的TCID50為10-5.333·100 μL-1、含有重組質粒PLKO.1-3C-2的細胞測定病毒的TCID50為10-5.083·100 μL-1、含有重組質粒PLKO.1-3D-1的細胞測定病毒的TCID50為10-4.83·100 μL-1、含有重組質粒PLKO.1-3D-2的細胞測定病毒的TCID50為10-4.958·100 μL-1。結果表明，對照細胞測定的病毒TCID50無變化而轉染重組質粒的細胞測定病毒的TCID50下降顯著(圖3A)，而且PLKO.1-VP1-1的抑制效率為85.3%、PLKO.1-VP1-2的抑制效率為92.9%、PLKO.1-3C-1的抑制效率為71.3%、PLKO.1-3C-2的抑制效率為84.1%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為90.8%、PLKO.1-3D-2的抑制效率為87.8%(圖3B)。

A. 3D標準曲線; B. FMDV RNA表達量的計算; ***. P<0. 01A. Standard curve FMDV 3D gene; B. The calculation FMDV RNA expression quantity; ***. P<0.01圖2 重組質粒轉染BHK21細胞后FMDV RNA表達量Fig.2 Recombinant plasmid transfection BHK21 cells after FMDV RNA expression quantity

2.4 RT-PCR 檢測慢病毒干擾載體對FMDV抑制效率

將收集得到的慢病毒感染BHK21細胞，使用5 μg·mL-1嘌呤霉素篩選。發(fā)現(xiàn)未感染慢病毒干擾載體的細胞4 d以后死亡，而試驗組細胞正常存活，證明成功構建慢病毒。傳代培養(yǎng)篩選出的細胞，得到穩(wěn)定的細胞系。將篩選穩(wěn)定的細胞轉入6孔板中，每孔加入200個TCID50的ON口蹄疫病毒。觀察12、18、24 h后細胞的病變情況并提取細胞的總RNA，進行RT-PCR檢測，并進行數(shù)據分析。12 h 慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的抑制效率為95.49%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為92.4%；18 h慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的抑制效率為94.82%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為89.9%；24 h 慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的抑制效率為94.67%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為88.3% (圖4)。數(shù)據分析結果表明慢病毒干擾載體可以有效地抑制FMDV的復制。

A.測定病毒的效價; B.計算對病毒復制的抑制；**. 0.01

***. P<0.01圖4 BHK21穩(wěn)定細胞系感染FMDV后FMDV RNA量Fig.4 BHK21 stable cell line FMDV RNA expression amount after FMDV infection

2.5 含有慢病毒干擾載體的細胞測定病毒的TCID50

使用正常BHK21細胞和篩選穩(wěn)定的細胞測定病毒的TCID50，得到對照細胞測定病毒的TCID50為10-5.875·100 μL-1，含有慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的細胞測定病毒的TCID50為10-4.542·100 μL-1、含有慢病毒干擾載體PLKO.1-3D-1的細胞測定病毒的TCID50為10-4.725·100 μL-1。結果表明對照細胞測定的病毒TCID50無變化而含有慢病毒干擾載體的細胞測定病毒的TCID50下降顯著(圖5A)而且PLKO.1-VP1-2的抑制效率為95.3%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為92.9%(圖5B)。

A．測定病毒的效價；B.計算對病毒的抑制； ***.P<0.01A. The determination of virus titer; B. The calculation of Inhibition efficiency of virus; ***. P<0.01圖5 含慢病毒干擾載體的細胞測定病毒的TCID50Fig.5 The TCID50 of the FMDV in cells with lentiviral vector

3 討 論

FMDV復制速度快、周期短、傳染力強，在全球大部分的地區(qū)流行，嚴重阻礙了世界畜牧業(yè)的發(fā)展，造成了嚴重的經濟損失[17]。目前還沒有特異針對該病的治療方法，主要采用疫苗免疫接種的方法，但接種疫苗7 d后才能引起有效的保護反應，不能及時控制病毒的傳播與復制，而且此種方法在生產過程中容易造成活病毒的逃逸或者免疫動物產生新的變異等弊端[18]。在之前的報道中，證實RNAi技術可以抑制FMDV在細胞內的復制并且取得了良好的效果[19]。3D、3C、VP1是口蹄疫病毒復制過程中的主要蛋白，均可選為RNAi的目標[20]。本研究使用RNAi干擾技術針對ON口蹄疫病毒3D、3C、VP1基因的高度保守區(qū)設計靶序列，從而有效地抑制ON口蹄疫病毒的復制。

現(xiàn)今抗病毒感染的有效方法之一就是利用RNAi技術在體內外抑制病毒的復制，并且該技術已經取得了深遠的進步[21]。目前使用最多的是將人工設計合成的siRNA片段克隆到表達載體上，轉入整合到宿主細胞基因組內讓siRNA 表達，引起相關的酶復合物與靶序列mRNA相結合，從而使特定的目的基因不表達或表達水平降低[22]。針對病毒靶基因的選擇、針對病毒靶基因引物的設計合成對 RNA干擾效果影響很大，因此靶基因的選擇對干擾效果非常的重要[23]。本研究針對ON株口蹄疫病毒3D、3C、VP1基因的高度保守區(qū)設計了6對靶向shRNA，構建重組表達質粒轉染至BHK21細胞，在細胞內通過沉默3D、3C、VP1基因的表達，從而抑制病毒蛋白的合成，最終降低了病毒的復制效率。通過RT-PCR 和病毒TCID50的測定，結果表明含有重組質粒組與陽性對照相比其抑制率在71.5%～93.2%，其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最為明顯。本研究成功構建了靶向ON口蹄疫病毒的重組表達質粒，并且能夠有效的抑制FMDV在細胞內的增殖。

慢病毒載體的宿主細胞廣泛、感染效率高、攜帶的目的基因導入宿主細胞內可以長期穩(wěn)定的表達、同時可以容納多個轉錄啟動子和容納大片段的外源基因[24]。其作為一種理想的基因轉移工具，并應用于一些科學領域的研究，例如慢病毒載體成為一個高效實用的基因轉移工具應用于RNAi研究領域[25]。目前，慢病毒載體與傳統(tǒng)的轉基因方法相結合，被廣泛的用于制備轉基因動物的研究[26]。本研究將干擾效果比較好的PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1重組表達質粒包裝成慢病毒，通過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定的細胞系，然后用 ON FMDV 去感染篩選的細胞系，收集12、18、24 h的細胞毒液提取 RNA，做 RT-PCR 分析數(shù)據，結果表明含有慢病毒干擾載體組與陽性對照相比其抑制率在88.3%～95.49%。本研究表明慢病毒制備成功，為后續(xù)抗口蹄疫病毒轉基因羊的生產培育奠定了基礎。

4 結 論

采用RNAi技術在細胞水平上篩選出能夠高效抑制ON 口蹄疫病毒復制的PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1重組質粒并成功制備慢病毒，為后續(xù)抗口蹄疫病毒轉基因羊的生產培育奠定了基礎。

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