韓 杰，熊顯榮，蔡雯祎，楊顯英，阿果約達，張燕紅，李 鍵

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

牦牛 (Bosgrunniens)生活在我國高原及其周圍海拔3 000 m以上高山地區(qū)，能夠很好地適應(yīng)高寒、缺氧的生態(tài)環(huán)境，能充分利用高原地區(qū)天然草地為人們提供優(yōu)質(zhì)健康的食品。然而牦牛性成熟晚，繁殖和生長性能低下，嚴重阻礙了牦牛業(yè)和經(jīng)濟的發(fā)展。近些年，對牦牛育種的研究不斷深入，并取得了一定的進展[1-2]。牦牛在動物基因遺傳資源研究中也是一個極其珍貴的基因庫[3]，因此，牦牛的研究對提高牧區(qū)的生活水平和豐富中國遺傳資源多樣性具有重大意義。

組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一個可逆過程，分別由賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶(KTMs)和去甲基化酶(KDMs)兩個家族催化完成，其中KDM家族成員均包含JmjC催化結(jié)構(gòu)域蛋白，這些JmjC催化結(jié)構(gòu)域?qū)儆赾upin金屬酶催化超家族[4-5]。這些酶在酵母、人、小鼠等物種間高度保守[6]，并且可以使甲基化的組蛋白脫甲基化，改變其表觀結(jié)構(gòu)，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)造、損傷和修復(fù)及基因活性等作用，進而對基因組功能進行調(diào)控[7]。KDM4家族是由4個成員構(gòu)成，包括：KDM4A、KDM4B、KDM4C和KDM4D，它們能夠維持特異性催化H1.4K26me2/3、H3K9me2/3和H3K36me2/3的去甲基化[8]。KDM4組蛋白去甲基化酶家族除了包含JmjC催化結(jié)構(gòu)域外，一側(cè)還包括JmjN催化結(jié)構(gòu)域，同樣是催化組蛋白尾去甲基化所必須的[9-11]。組蛋白賴氨酸去甲基化酶4A(又稱為KDM4A/JMJD2A/JHDM3A)可以催化H3K9me2/3和H3K36me2/3去甲基化[12]。對KDM4A基因的研究表明，其蛋白和mRNA廣泛存在于生殖系統(tǒng)以及各個組織中，且KDM4A基因可通過影響周期蛋白和激素受體來間接調(diào)控生殖細胞的活動，進而參與生殖系統(tǒng)的調(diào)控[12-17]。

目前，關(guān)于KDM4A基因的研究主要集中在人和動物的生長發(fā)育和腫瘤等相關(guān)疾病上，而該基因在牦牛生殖細胞中的研究未見相關(guān)報道，為進一步研究KDM4A基因在牦牛卵母細胞及顆粒細胞中的作用，本研究克隆獲得牦牛KDM4A基因，并對該基因序列進行生物信息學(xué)及蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測分析；應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測牦牛KDM4A基因在顆粒細胞和卵母細胞成熟過程中的表達情況，為進一步研究牦牛的KDM4A基因及其在牦牛生殖生理過程中所發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Trizol Reagent購自Invitrogen(美國)公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TaqTMDNA聚合酶、pMDTM19-T載體、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa(大連)公司，DNA膠回收試劑盒購自Axygen(北京)公司， DNA Marker、感受態(tài)細胞DH5α均購于天根生化科技(北京)有限公司，卵母細胞成熟液M199(添加雌二醇、FSH、LH、血清成分)購自Gibco公司，其他無特殊說明均為國產(chǎn)分析純生化試劑。離心機、熒光定量PCR儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱均購自美國Biodine rad公司。

1.2 牦牛組織樣品的采集

試驗樣品采自四川成都青白江區(qū)向陽鎮(zhèn)屠宰場，屠宰后，立即無菌采集牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸、卵巢、子宮、胃、睪丸、大腦11個組織；所有樣品放入已編號的凍存管中，迅速將其投入液氮中保存。

1.3 牦牛卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng)

采集的卵巢，用含雙抗的生理鹽水(80 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)沖洗干凈，放入25 ℃生理鹽水(預(yù)先放入雙抗)的保溫瓶中，在2 h內(nèi)送回實驗室。用加有雙抗的37 ℃生理鹽水沖洗牦牛卵巢3遍后，使用一次性注射器(12號針頭)抽取直徑約為3～8 mm卵泡的卵泡液，將獲得的卵泡液置于90 mm的平皿中，輕輕搖勻，在體視顯微鏡下，收集卵丘-卵母細胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complex，COCs)。將所取得的復(fù)合體放入卵母細胞成熟液中清洗3遍，移入50 μL的卵母細胞成熟液的微滴(每個微滴中放25個卵母細胞并由甘油覆蓋)中，38.5 ℃，5% CO2，高濕度條件下培養(yǎng)[18]，分別收集GV期、MI期和MII期卵母細胞及顆粒細胞，置于去RNA酶的離心管中。

1.4 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

按照Trizol法提取樣本組織的總RNA。采用Cell-to-cDNATMII Kit試劑盒，對培養(yǎng)得到的不同時期的顆粒細胞和卵母細胞進行總RNA的提取。應(yīng)用核酸分析儀測其純度和濃度，選用OD值為1.8～2.0的RNA作為模板。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書以O(shè)ligo(dT)為引物，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，分別編號后，-20 ℃保存。

1.5 引物設(shè)計及合成

根據(jù)NCBI中已報道的黃牛(Bostaurus)KDM4A(GenBank登錄號：NM_001206316.1)和GAPDH(GenBank登錄號：AC_00162.1)基因的mRNA序列，使用Primer5.0軟件設(shè)計引物(表1)，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.6 目的基因的擴增克隆

以牦牛卵巢cNDA為模板，利用PCR技術(shù)擴增牦牛KDM4A基因CDs區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中 cNDA 1.0 μL，Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL， ddH2O 9.5 μL；PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s(前兩段目的基因退火溫度為58 ℃，第3段目的基因退火溫度為56 ℃),72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。并使用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，根據(jù)DNA膠回收試劑盒說明書切膠回收目的條帶，然后將回收產(chǎn)物與pMDTM19-T載體在16 ℃連接過夜，第2天將DH5α感受態(tài)細胞均勻涂于已制備好的LB固體培養(yǎng)基(AMP+)平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取白色單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(AMP+)中搖床培養(yǎng)6 h，以菌液為模板進行PCR鑒定，將鑒定結(jié)果呈陽性的菌液，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

表1 引物信息

Table 1 Primer information

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物長度/bpProductsize用途UtilizationKDM4A-1F1:CCTTCTGCGATTTCTGCCR1:GGCTTCCTGAGTCACCTTGT58840KMD4AcDNA擴增AmplificationofcDNAofKDM4AKDM4A-2F2:CCGAAGACATGGACTTGTACR2:CCCTTGGACTTCTTACTCTC581225KDM4AcDNA擴增AmplificationofcDNAofKDM4AKDM4A-3F3:GAGGTTGCGGATGAATATR3:GCCTTGATGACTGGGACT561504KDM4AcDNA擴增AmplificationofcDNAofKDM4AGAPDHF:TGCTGGTGCTGAGTATGTGGTGR:TCTTCTGGGTGGCAGTGATGG60293內(nèi)參基因擴增AmplificationofreferencegenesKDM4AF4:GGCCATGACTGTGCGAGAGR4:AAGTCCATGTCTTCGGTGTGC60312半定量RT-PCR及實時熒光定量PCRSemi-quantitativePCRandrealtimequantitativePCR

F.正向引物；R.反向引物

F.Forword primer; R.Reverse primer

1.7 牦牛KDM4A基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI中ORF Finder對獲得的KDM4A序列進行開放閱讀框分析，并獲得氨基酸序列，同時進行氨基酸相似性比對；利用在線軟件ExPASY工具包中Protparam、ProtScale、SignalP、TMHMM、NetPhos、SOPMA、SWISS-MODEL及SMART分別對牦牛KDM4A蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、信號肽、跨膜區(qū)、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測分析；在NCBI中找到需要建樹的相關(guān)物種該基因序列，下載保存后，并利用MEGA 5.0軟件進行比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.8 牦牛KDM4A基因組織表達譜

采用RT-PCR檢測KDM4A基因在牦牛心、胃、肝、肺、卵巢、脾、腎、小腸、子宮、睪丸、大腦組織中的表達，RT-PCR反應(yīng)體系為25 μL: Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，各組織cNDA模板1.0 μL， ddH2O 9.5 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，40個循環(huán);72 ℃ 7 min。最后使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.9 牦牛卵母細胞和顆粒細胞中KDM4A基因表達分析

采用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, RT-qPCR)檢測牦牛GV期、MI期及MII期的卵母細胞和顆粒細胞中KDM4A基因的表達。RT-qPCR反應(yīng)體系為15 μL：其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cNDA 1.0 μL， ddH2O 5.5 μL；PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s, 共40個循環(huán)。每個樣本進行3次重復(fù)，用2-ΔΔCt法對定量結(jié)果進行分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤(Mean±S)”表示，采用SPSS 18.0軟件進行顯著性分析，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛KDM4A基因CDS擴增及克隆測序

經(jīng)RT-PCR方法擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得和預(yù)期目的基因KDM4A片段大小一致的單一清晰條帶(圖1)，進一步克隆測序驗證獲得牦牛KDM4A基因核苷酸序列為3 289 bp(圖2)，包括48 bp的5′端非編碼區(qū)，3 201 bp的CDs區(qū)和40 bp的3′端非編碼區(qū)。

M.DL2000 DNA marker；1.KDM4A-1 PCR 產(chǎn)物；2.KDM4A-2 PCR產(chǎn)物；3.KDM4A-3 PCR產(chǎn)物；4.陰性對照(ddH2O)M.DL2000 DNA marker; 1. KDM4A-1 PCR product of yak KDM4A; 2. KDM4A-2 PCR product of yak KDM4A; 3. KDM4A-3 PCR product of yak KDM4A; 4.Negative control(ddH2O)圖1 牦牛KDM4A基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result for PCR amplification of yak KDM4A

2.2 物種間KDM4A基因同源性比較及進化樹構(gòu)建

利用DNAMAN軟件將克隆測序所得的牦牛KDM4A基因CDs區(qū)與黃牛(NM_001206316.1)、山羊(XM_018043005.1)、馬(XM_005607123.2)、貓(XM_019836867.1)、人(NM_014663.2)、犬(XM_005629109.2)、獼猴(XM_015136353.1)、小鼠(NM_001161823.1)、綿羊(XM_015091927.1)、野豬(XM_013992005.1)、原雞(XM_015291306.1)、爪蟾(NM_001114026.1)的進行比對，同源性分別為99.6%、94.5%、90.6%、89.9%、89.4%、88.4%、88.1%、85.4%、84.2%、76.7%、73.2%、69.1%。使用MEGA 5.0軟件對13個物種KDM4A基因編碼區(qū)序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，KDM4A基因CDs區(qū)核苷酸具有很高的保守性，牦牛與黃牛KDM4A基因的親緣關(guān)系最近，其次是山羊等(圖3)。

2.3 牦牛KDM4A蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

采用ExPASY中Protparam在線工具對該蛋白理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，其分子式為C5388H8382N1496O1656S58，相對分子質(zhì)量122.48 ku，理論等電點5.71，總原子數(shù)16 980，帶負電殘基數(shù)(Asp+Glu) 161，帶正電殘基數(shù)(Arg+Lys) 138。出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基有Glu(9.8%)、Ser(8.4%)、Leu(7.2%)、Ala(6.8%)，且不包括吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)?？偲骄H水性-0.567<0，脂肪系數(shù)67.81，估計哺乳動物網(wǎng)織紅細胞(體外)半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為55.55。綜上推測，KDM4A蛋白可能是親水不穩(wěn)定的酸性蛋白。

上行表示牦牛KDM4A基因核苷酸序列；下行表示推測的氨基酸序列。下劃線表示起始密碼子；*表示終止密碼子The upper lines show the nucleotide sequence and the lower lines show the deduced amino acid sequence of KDM4A. The initial codon ATG is underlined; * indicates the terminal codon TAG圖2 牦牛KDM4A基因核苷酸及其推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of yak KDM4A

疏水性預(yù)測分析顯示，KDM4A蛋白親水性分值在第478位和第479位最小為-3.500，第880位最大為2.389，且較大多數(shù)氨基酸殘基具有親水性，推測該蛋白是親水性蛋白，與所分析的蛋白理化性質(zhì)結(jié)果一致?？缒そY(jié)構(gòu)域和信號肽分析表明，牦牛KDM4A蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。蛋白修飾磷酸化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白有絲氨酸(Ser)位點68個，蘇氨酸(Thr)位點31個和酪氨酸(Tyr)位點16個。KDM4A蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測知，360個α-螺旋占33.33%，99個β-轉(zhuǎn)角占9.17%，409個無規(guī)卷曲占37.87%，212個延伸鏈占19.63%(圖4)?？赏茰yα-螺旋和無規(guī)卷曲為該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要的組成元件，這與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示結(jié)果基本相符(圖4)。對該蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白包括6個結(jié)構(gòu)域。其中JmjN domain為第13～55位氨基酸；JmjC domain為第142～308位氨基酸；PHD domain有兩個分別為第711～769和第831～887位氨基酸；TUDOR domain有兩個分別為第899～956和第957～1 013位氨基酸(圖5)。

圖3 不同物種間基于KDM4A的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of KDM4A of various species

圖4 牦牛KDM4A蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Tertiary structure prediction of KDM4A protein in yak

圖5 牦牛KDM4A蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 The domain prediction of KDM4A protein in yak

2.4 牦牛KDM4A基因的組織表達譜

采用普通PCR方法，以GAPDH為內(nèi)參基因，對KDM4A基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸、卵巢、子宮、胃、睪丸、大腦組織中表達情況進行研究，結(jié)果顯示，在牦牛各組織中KDM4A基因普遍表達，但存在差異，其中該基因在睪丸、脾、卵巢中的表達相對較高，肝、肺、小腸、子宮、胃中的表達次之，在心、腎和大腦中的表達相對較低(圖6)。

2.5 牦牛不同時期卵母細胞及顆粒細胞中KDM4A基因的表達

以內(nèi)參基因GAPDH作為參照，利用實時熒光定量PCR，檢測KDM4A基因在牦牛卵母細胞和顆粒細胞成熟過程中mRNA的表達情況(圖7)。以GV期卵母細胞KDM4A基因的表達量作為參考，約為MI期和MII期卵母細胞中KDM4A基因表達量的1.8倍和2.6倍(P<0.05),MI期和MII期卵母細胞中KDM4A基因表達差異不顯著(P>0.05)(圖7A)。以GV期顆粒細胞中KDM4A的表達量作為參照，MII期顆粒細胞中的KDM4A的表達量約為GV期的1.7倍(P<0.05)，與MI期顆粒細胞中KDM4A的表達量差異不顯著(P>0.05)(圖7B)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準DL2000; 1.肝；2.睪丸；3.心；4.脾；5.肺；6.小腸；7.卵巢；8.腎；9.子宮；10.大腦；11.胃M.DNA marker DL2000; 1.Liver; 2. Testis; 3. Heart; 4. Spleen; 5. Lung; 6. Intestine; 7. Ovary; 8. Kidney; 9. Uterus; 10. Cerebrum; 11.Stomach圖6 牦牛KDM4A基因的組織表達Fig.6 Tissues expression of KDM4A gene in yak

相同字母代表差異不顯著(P>0.05)；不同字母代表差異顯著(P<0.05)The same letter shows no significant difference between stages(P>0.05); different letters show significant difference (P<0.05)圖7 KDM4A基因在牦牛不同時期卵母細胞(A)和顆粒細胞(B)中的表達水平Fig.7 The expression of KDM4A in yak during different stages of oocyte (A) and granulosa cell (B)

3 討 論

KDM4A是KDM4家族成員之一，該基因主要催化H3K9me2/3和H3K36me2/3去甲基化。KDM4A作為轉(zhuǎn)錄抑制因子能調(diào)節(jié)細胞周期及卵母細胞的發(fā)育。因此，KDM4A的研究對探索卵母細胞減數(shù)分裂調(diào)控機制有一定作用。

本研究成功克隆并獲得了牦牛KDM4A基因包含完整CDs區(qū)的核苷酸序列，與黃牛對比，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)存在10個堿基突變，使編碼區(qū)第261位和第508位氨基酸，變化由T→P，E→K，但這種氨基酸的突變是否對該蛋白的功能有影響需更深入的研究。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與黃牛、山羊等的同源性較高，且與進化樹分析的親緣關(guān)系相符，暗示牦牛KDM4A基因在進化中具有較高的保守性[6]。

本試驗檢測了KDM4A基因在牦牛不同組織中的表達，并通過普通PCR對KDM4A基因的組織表達分析表明，該基因mRNA在牦牛的心、脾、肝、肺、卵巢、腎、子宮、睪丸、大腦、小腸、胃中均有表達，這與文獻[19]的結(jié)果一致，且其表達量在睪丸、脾、卵巢中較高，在睪丸中表達量高的原因可能和KDM4A與結(jié)合了配體的雄激素受體進一步結(jié)合，形成復(fù)合物，大大提高其受體活性有關(guān)[20]。Y.Yaron等[21]發(fā)現(xiàn)，Tp53對卵巢功能有一定的調(diào)節(jié)作用，主要是與卵泡的選擇閉鎖和卵巢內(nèi)分泌有關(guān)。同時，編碼P53蛋白的基因Tp53的信使RNA表達水平受KDM4A信使RNA的表達水平影響，并呈正相關(guān)。因此，推測KDM4A基因可通過調(diào)控Tp53蛋白的表達，參與卵巢功能的調(diào)節(jié)，所以該基因在卵巢中表達量較高。還有研究發(fā)現(xiàn)該基因在多種腫瘤疾病中有超表達[19]，從以上結(jié)果可推測，KDM4A基因除了參與哺乳動物生殖系統(tǒng)外，還參與免疫、消化、神經(jīng)、骨骼肌及內(nèi)分泌等系統(tǒng)的相關(guān)生物學(xué)調(diào)節(jié)。在生物體中KDM4A自身蛋白水平具有細胞周期依賴性，并且其自身蛋白含量通過蛋白-泛素酶體途徑調(diào)控[12]。

卵丘細胞是在卵母細胞周圍與之進行代謝聯(lián)系的顆粒細胞群，其主要功能是維持卵母細胞減數(shù)分裂、誘導(dǎo)其發(fā)生減數(shù)分裂、以及在促進細胞質(zhì)的成熟方面起一定作用。同時，卵母細胞在顆粒細胞成熟分化等方面也起著不可或缺的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，KDM4A基因可通過調(diào)控顆粒細胞表面的激素受體來間接調(diào)控該細胞的增殖分化，同時，該基因也可以通過影響細胞周期蛋白的表達來影響卵母細胞減數(shù)分裂[17,22]。因此，研究該基因在卵母細胞和顆粒細胞中的表達對進一步探討該基因?qū)﹃笈Ｉ硻C能的調(diào)控有一定意義。

本研究采用實時熒光定量PCR的方法檢測了該基因在牦牛的卵母細胞及顆粒細胞成熟過程中的表達差異。結(jié)果指出，KDM4AmRNA在這兩種細胞發(fā)育的不同時期均有表達，但其表達量存在差異，表明KDM4A基因在卵母細胞及顆粒細胞成熟過程中發(fā)揮著不可忽視的作用。并對KDM4A基因在不同時期的顆粒細胞中的表達量進行分析，結(jié)果顯示，KDM4A基因在MII期表達量較其它時期高。有研究發(fā)現(xiàn)，KDM4A可以作為雌激素受體(ERα)、雄激素受體(AR)的輔激活子，激活它們各自靶基因,有助于雌激素與顆粒細胞上的ER結(jié)合，促進顆粒細胞分化[12,16]；雄激素與顆粒細胞上的AR結(jié)合，促進顆粒細胞增殖[17]。B.X.Li等[20]發(fā)現(xiàn)KDM4A可調(diào)控P53的表達水平，并且呈正相關(guān)。Tp53(編碼P53的基因)可促進排卵后的顆粒細胞轉(zhuǎn)化為顆粒黃體細胞，并對顆粒黃體細胞分泌催產(chǎn)素、孕酮和前列腺素E有促進作用，從而對前列腺素E的分泌產(chǎn)生抑制作用[23]，因此該基因在MII期表達量較高。隨后，對KDM4A基因在不同時期的卵母細胞中表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在GV期表達水平較其他時期高。研究表明，MPF在卵母細胞成熟過程中起一定的調(diào)控作用，并且MPF的活性受cyclinB量的影響[24]。J.J.Eppig等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大量的cyclinB在GVBD后小鼠卵母細胞中合成以提高MPF水平，促進卵母細胞發(fā)育成熟至MII期。高揚[25]發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲低KDM4A會使cyclinB1的表達明顯增高。同時，普遍認為處于高活性狀態(tài)的MPF，可使卵母細胞維持在MII期不向后轉(zhuǎn)變[26]。由此可以推測，KDM4A在卵母細胞不同時期的表達水平可能與其對cyclinB1的表達調(diào)控有關(guān)。綜合兩個圖可以看出，KDM4A基因在兩種細胞中表達變化趨勢是不一致的，其原因可能是KDM4A基因?qū)β涯讣毎皖w粒細胞的調(diào)控機制及在其中發(fā)揮的生物學(xué)功能不同所致。綜上所述，KDM4A基因參與牦牛卵母細胞和顆粒細胞的成熟過程。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆獲得了牦牛KDM4A基因序列。生物信息學(xué)分析表明，KDM4A基因編碼區(qū)在生物進化中具有很高的保守性。本試驗使用熒光定量PCR檢測KDM4A基因在牦牛卵母細胞及顆粒細胞中的表達，且在不同時期mRNA表達量存在明顯差異，表明，KDM4A基因參與了卵母細胞及顆粒細胞的成熟過程。為進一步研究KDM4A基因?qū)﹃笈Ｉ硻C能的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

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