楊 楠，張志強，吳同壘，王洪彬，史秋梅，高桂生(河北科技師范學院，河北秦皇島 066604)

美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)又稱?；【?，是海洋革蘭氏陰性球桿菌，包括美人魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.Damsela；PDD)和殺魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.Piscicida;PDP)兩個亞種，在美國、日本、歐洲和我國的海水養(yǎng)殖中為常見的病原菌[1-2]。該菌是嗜鹽病原菌中的重要成員，是一種機會致病菌，廣泛存在于海水及寄生于海產(chǎn)動物中，沒有明顯的宿主特異性，能夠感染多種海洋經(jīng)濟魚類，造成大批死亡；比如雀鯛科魚[3]、卵形鯧鲹[4]、斑節(jié)對蝦[5]、鯡魚[6]等；也有報道稱，該菌還能感染甲殼類、軟體動物、爬行動物[7]。在海洋哺乳動物中，1988年首次報道美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種從發(fā)病寬吻海豚體內(nèi)分離[6]?；疾◆~臨床表現(xiàn)為敗血癥，體表潰瘍，腮部、鰭部出血，斷尾；該菌發(fā)病迅速，死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)的造成重大經(jīng)濟損失。對人而言，PDD是一種人魚共患病病原菌，機會性感染暴露于鹽水或半咸水域和海洋活動過程中造成的傷口，可能會演變?yōu)閴乃佬越钅ぱ咨踔林旅黐8]。

2016年5月，秦皇島市昌黎縣某海水養(yǎng)殖基地，大批舌鰨突然死亡，死亡率高達25%。病魚食欲不振，不喜活動，脫離魚群，體表潰瘍，腮鰭部出血，有的甚至斷尾；剖檢可見腸道充血，腹水嚴重，肝臟腫脹充血，腎臟微黃。研究從病魚體內(nèi)分離出優(yōu)勢菌株，進行PCR鑒定、生化特性鑒定，最終確定分離菌是美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種。

1 材 料

1.1 病料樣品 河北秦皇島市昌黎縣某海水養(yǎng)殖基地病死舌鰨魚，體重在420～780 g之間。

1.2 實驗材料 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購自青島高科園海博生物技術有限公司；血瓊脂平板(兔血)購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；藥敏片，購自杭州微生物試劑公司；2×Es Taq MasterMix，購自康為世紀公司； 16S rDNA所用引物，均由北京生工生物工程有限公司合成；克隆菌株DH5α為實驗室保存；ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)，由法國梅里埃公司生產(chǎn)；ID32E鑒定試劑條購自北京威泰科生物技術有限公司。

1.3 實驗動物 試驗用舌鰨魚購自某水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，體重約200 g/尾；清潔級BALB/c小鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所；實驗動物試驗前均在實驗室自由采食1周，以適應環(huán)境。

2 方 法

2.1 細菌分離與鑒定

2.1.1 細菌的分離培養(yǎng)與鏡檢 無菌采集心血接種于營養(yǎng)瓊脂上，30 ℃培養(yǎng)12 h，平板上長出均一菌落，挑取單菌落于血液瓊脂上進行菌落形態(tài)和溶血性觀察；對分離菌株進行革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌染色特性及形態(tài)；選取優(yōu)勢菌落接種于普通LB液體培養(yǎng)基中，劃線于兩個兔血瓊脂平板上，分別置于30 ℃和37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察分離菌株是否于37 ℃生長。

2.1.2 分離菌株的16S rDNA 基因序列分析 抽提分離菌株基因組并以其為模板進行PCR，引物為27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。50 μL PCR體系：2×Taq PCR Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 22 μL，模板1 μL?；厥漳康幕蚱?，與pMD18-T連接后轉入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞；挑單菌落PCR檢測，陽性菌株提取質(zhì)粒并送測序。

測序結果經(jīng)過拼接后，在NCBI上Blast工作區(qū)上進行序列比對，下載同源性高的菌株序列以及相關菌種的16SrRNA序列，進行同源性分析、構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.1.3 生化鑒定 采用ATB自動生化鑒定系統(tǒng)：將分離菌株接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，刮取菌落接種生理鹽水，調(diào)整菌液濃度至0.5個麥氏濁度， 將菌液加入ID32E生化鑒定試紙條樣品孔中，40 μL/孔，并在厭氧培養(yǎng)的孔中加入一滴礦物油，置于濕盒中，30 ℃培養(yǎng)24 h；次日在吲哚實驗孔加入一滴James染液，將試紙條置于ATB自動鑒定系統(tǒng)中進行鑒定。

2.2 藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作和結果判斷。

2.3 動物致病性試驗及分離菌LD50檢測

2.3.1 動物致病性試驗 將純培養(yǎng)分離菌接種于LB培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)10 h，用生理鹽水洗滌，調(diào)整菌液為1.0×108CFU/mL。選取12只健康舌鰨魚，隨機分成3組，2個實驗組，1個對照組，每組4尾。實驗組每尾腹腔注射0.2 mL菌液，對照組注射0.2 mL生理鹽水，連續(xù)觀察4 d，記錄試驗舌鰨魚發(fā)病死亡情況，并對病死魚進行細菌分離鑒定。

2.3.2 分離菌對舌鰨魚的LD50檢測 選取健康舌鰨魚60尾，隨機分成6組，5組為實驗組，1組為對照組，每組10尾。用滅菌生理鹽水稀釋菌液至1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102CFU/mL五個實驗梯度，實驗組每尾腹腔注射0.2 mL菌液，對照組每尾腹腔注射等體積的生理鹽水。攻毒后72 h觀察患病及死亡情況，用寇氏改良法計算LD50，并對病死魚進行剖檢、細菌分離鑒定。

2.3.3 分離菌對BALB/c小鼠的LD50檢測 選取健康BALB/c小鼠60只，分組處理同2.3.2。用滅菌生理鹽水稀釋菌液至1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104CFU/mL五個實驗梯度，實驗組小鼠腹腔注射0.1 mL菌液，對照組注射等體積生理鹽水；其余操作同2.3.2。

3 結 果

3.1 細菌分離與鑒定

3.1.1 細菌分離培養(yǎng)與鏡檢 從半滑舌鰨中分離出一株細菌，在兔血平板長出半透明，圓形光滑、中間較隆起、邊緣整齊中等大小菌落，呈現(xiàn)典型的β型溶血(圖1)，為革蘭氏染色陰性的球桿菌(圖2)。

圖1 分離菌血瓊脂培養(yǎng)Fig 1 Blood agar medium

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢結果Fig 2 Gram staining

3.1.2 分離菌株的16S rDNA基因序列分析 以抽提分離菌株基因組為模板，16S rDNA引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于1500 bp(圖3)出現(xiàn)目的條帶。分離菌株16S rDNA基因序列與GenBank上公布的美人魚發(fā)光桿菌參考株高度同源，證實其確為美人魚發(fā)光桿菌。利用Lasergene軟件上的MegAlin分區(qū)對分離菌與美人魚發(fā)光桿菌標準株ATCC33539、CECT5064 等參考菌株進行序列比對。結果顯示(圖4、圖5)，分離菌株與美人魚發(fā)光桿菌處于同一分支，進一步說明分離菌株為美人魚發(fā)光桿菌。

M：DNA標準DL2000；1：從心血中分離菌的16S rDNA擴增產(chǎn)物M:DL2000 Marke；1:PCR products of positive strains from the heart blood圖3 分離菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物Fig 3 PCR result of 16S r DNA gene from Isolated bacteria

圖4 分離菌株16S rDNA同源性比較Fig 4 Homology comparison of nucleotide sequences of 16 S rDNA gene

圖5 分離菌株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 5 Phylogenetic analysis based on sequences 16 S rDNA gene

3.1.3 分離菌生化鑒定結果 對分離菌株進行生化特性鑒定證實其為美人魚發(fā)光桿菌，進一步檢測分離菌株七葉苷發(fā)酵陽性，37℃生長良好，證實其為美人魚亞種。

表1 分離菌株主要生化指標Tab 1 Main phenotypic traits of the isolate

“+”表示陽性；“-”表示陰性。

"+"positive;"-"negative.

3.2 藥敏試驗 藥敏試驗共計使用21種藥物，結果顯示，分離菌對恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、乙酰甲喹敏感；對頭孢拉定、多西環(huán)素中敏；對大觀霉素、慶大霉素、林可霉素、二甲氧嘧啶、新諾明、替米考星、間甲氧嘧啶、青霉素、鏈霉素、土霉素、氨芐青霉素、新霉素、頭孢曲松、卡那霉素、阿米卡星不敏感。

3.3 分離菌動物回歸試驗及LD50檢測

3.3.1 分離菌動物回歸試驗 實驗組舌鰨魚在接種分離菌12 h后出現(xiàn)死亡，36 h全部死亡；對照組無死亡。實驗組舌鰨魚腮部有出血癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫脹，腸粘膜出血，這與最初分離菌的癥狀相符。從死亡舌鰨魚內(nèi)臟分離細菌培養(yǎng)，按照上述方法鏡檢、PCR試驗、生化鑒定，確定該病菌與養(yǎng)殖場病死舌鰨魚體內(nèi)分離的細菌一致，均為美人魚發(fā)光桿菌。

3.3.2 分離菌對舌鰨魚的LD50檢測 5個試驗梯度中，第1組舌鰨魚在攻毒16 h后出現(xiàn)死亡，第1、2組舌鰨魚48 h內(nèi)全部死亡，連續(xù)觀察一周，第5組和對照組無死亡。根據(jù)表2數(shù)據(jù)，利用寇氏改良法計算出PDD對舌鰨魚的LD50=3.1×104CFU/mL。

3.3.3 分離菌對BALB/c小鼠的LD50檢測 實驗1組小鼠在接種病菌5 h后出現(xiàn)死亡，實驗1、2組小鼠在16 h內(nèi)全部死亡；對照組沒有死亡，連續(xù)觀察一周。根據(jù)表3數(shù)據(jù)，利用寇氏改良法計算出PDD對BALB/c小鼠的LD50=5.0×105CFU/mL。

表2 分離菌半數(shù)致死量檢測結果Tab 2 Median lethal dose of isolated bacteria

表3 分離菌半數(shù)致死量檢測結果Tab 3 Median lethal dose of isolated bacteria

4 討論與小結

美人魚發(fā)光桿菌包含美人魚殺魚亞種和美人魚亞種兩個亞種，其中美人魚亞種以前被稱為美人魚弧菌，具有某些弧菌特性，研究發(fā)現(xiàn)美人魚亞種細菌條件致病，感染宿主范圍廣泛，能夠感染多種魚類，亦可感染包括人在內(nèi)的哺乳動物，具有一定的公共衛(wèi)生學意義。PDD感染魚類主要引起細菌性敗血癥，死亡率較高。研究PDD分離自秦皇島某養(yǎng)殖基地病死舌鰨內(nèi)臟，病魚外觀表現(xiàn)與病理變化與PDD感染相似。

美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種最早從患有皮膚潰爛病的雀鯛魚[3]中發(fā)現(xiàn)，此后陸續(xù)從大菱鲆、海鯉、石斑魚、鯊魚以中分離得到[9]，但從半滑舌鰨魚種分離該菌尚屬首次。PDD感染致病的資料較少，對于其致病的報道多集中于國外，但其造成危害較大，尤其近年來該菌所致感染在我國呈上升趨勢，實驗室已多次從冀東沿海地區(qū)分離出該菌，應重視其潛在威脅。除此之外，對美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種進行研究的意義在于其具有的公共衛(wèi)生學價值，PDD能夠感染人已被證實，食源性途徑和傷口是人類感染的主要方式[10]。研究中所分離的菌株能夠在37 ℃生長良好，同時對舌鰨魚和小鼠均具有較強的致病性(半數(shù)致死量分別為3.1×104CFU/mL和5.0×105CFU/mL)，揭示了其對人類健康的潛在威脅。

目前，對于水產(chǎn)細菌病原的防治多以抗生素和化學藥物為主，其能夠?qū)毦圆≡幸欢ǖ闹委熜Ч?，但其所造成的抗生素殘留、水體污染以及誘導細菌多重耐藥情況不容忽視。對江蘇沿海地區(qū)水體細菌進行耐藥情況調(diào)查結果表明，江蘇省沿海地區(qū)分離的部分水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌出現(xiàn)多重耐藥，二重、三重、四重、五重耐藥率分別為 22.3%、13.5%、10.9%、6.6%，某些菌株甚至達到十一重耐藥[11]；上海地區(qū)分離菌株多重耐藥率為100%，海南地區(qū)分離菌株多重耐藥率為77.5%[12]。由此可見，海水弧菌的多重耐藥現(xiàn)象嚴重，各地區(qū)病原菌所耐藥物并不一致，存在地區(qū)差異。在水產(chǎn)上耐藥嚴重的病原菌有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌[13]、愛德華氏菌等[14]，其多重耐藥的情況已引起人們重視。若抗生素繼續(xù)不科學、不合理使用，可能會使耐藥菌演變?yōu)槌壖毦o水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康構成巨大威脅。通過長期對冀東地區(qū)水產(chǎn)病原進行監(jiān)測，所分離的部分菌株亦呈現(xiàn)明顯的多重耐藥情況。對研究分離的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種進行藥敏試驗結果顯示，分離菌株對多種抗生素不敏感，反映出本地水產(chǎn)細菌耐藥形勢嚴峻，可進一步檢測分離菌株的耐藥基因，為該病的防控提供參考。

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