劉超英，吳程華，高 洪，嚴(yán)玉霖，富國文，趙 汝(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

耶爾森菌強毒力島(The Yersinia High-pathogeniticity island，HPI)主要含有與攝鐵有關(guān)的毒力基因簇[1-3]。研究表明，耶爾森桿菌HPI不僅可以通過Ybt的鐵載體奪取宿主中的鐵元素進而加重機體的感染，而且可在耶爾森菌和E.coli之間水平傳播，與致病性E.coli的毒力進化有著密切的關(guān)系[4]。irp2基因是HPI中主要的功能基因，在鐵缺乏的條件下可表達高分子量蛋白(High Molecular Weight Protein 2，HMWP2)。高分子量鐵調(diào)節(jié)蛋白參與表達耶爾森桿菌素的陽性表型，被認為對鐵載體耶爾桿菌素的合成有著非常重要的作用。因此，致病性E.coli的irp2基因缺失株的構(gòu)建對致病機制的研究至關(guān)重要。

大腸桿菌基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用其自身的RecA同源重組系統(tǒng)編碼的RecA和RecBCD蛋白介導(dǎo)DNA的同源重組。但因該系統(tǒng)存在重組效率低等較多缺點，目前主要采用更為簡單迅速的Red同源重組系統(tǒng)的方法進行基因敲除[5-6]。利用該方法構(gòu)建致病性大腸桿菌(PathogenicE.coli，PEC)HPIirp2基因缺失株，不僅為HPI毒力致病機理研究提供技術(shù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，也為大腸桿菌病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 質(zhì)粒pKD46、pKD4、pCP20購自優(yōu)寶生物，5株E.coli(A-E)分離株由實驗室分離鑒定保存。試劑及試劑盒主要包括離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、2×power Taq MasterMix、Competent Cell Preparation Kit、Phusion Flash High-Fidelity PCR MasterMix、FastDigest DpnI限制性內(nèi)切酶等。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取和irp2基因的檢測 利用細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取CVCC1565、E.coli(A-E)分離株培養(yǎng)液的DNA，產(chǎn)物保存在-20 ℃，作為PCR模版?zhèn)溆?。根?jù)irp2基因序列(GenBank登錄號：L18881.1)的保守區(qū)域設(shè)計上下游引物，irp2-F(5'-3')：TTCCTTCAGCATCGCCTGTTA，irp2-R(5'-3')：CAAGCCCGACATACTCAATCT，由華大基因公司合成。以提取的DNA為模版，irp2-F/R為引物，進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸5 min。擴增結(jié)束后，經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在紫外燈下觀察結(jié)果，拍照。選擇E.coli(E)為試驗對象，送碩擎公司進行irp2基因測序。

1.2.2 Red同源重組引物的設(shè)計 根據(jù)pKD 4序列GENEBANK(AY048743.1)設(shè)計引物擴增兩側(cè)帶有FRT位點的卡那霉素抗性基因，在上下游引物5'端加入50 bp和45 bp的irp2基因的同源重組臂，同源重組引物為Q1/Q2(劃線部分為同源臂)；根據(jù)pKD 46序列(GenBank登錄號：AY048746.1)設(shè)計pKD46質(zhì)粒鑒定引物bet-F/R；根據(jù)pCP 20序列(GenBank登錄號：HB393402.1)設(shè)計pCP 20質(zhì)粒鑒定引物FLP-F/R；敲除鑒定引物為A1、A2、B1、B2，引物由華大基因合成。引物序列見表1：

表1 同源重組所用引物Tab 1 Primers of homologous recombination

1.2.3irp2缺失株的構(gòu)建 以質(zhì)粒pKD 4為模板，Q1、Q2為引物進行PCR反應(yīng)，制備打靶DNA片段。制作E.coli(E)細胞感受態(tài)，將pKD 46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后用特異性鑒定引物bet-F/R鑒定pKD 46陽性菌株，轉(zhuǎn)化成功的菌株命名為E.coli(E)/pKD 46。過夜培養(yǎng)后制備E.coli(E)/pKD 46電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞并進行電轉(zhuǎn)化，完成后取100 μL菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基(卡那霉素終濃度為50 μg/mL)上，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后使用鑒定引物A1、A2和B1、B2挑選卡那霉素抗性重組子(圖1)。挑選含有Kan+和Amp+雙抗性的陽性轉(zhuǎn)化株通過FLP重組酶刪除FRT位點之間的抗性序列。用鑒定引物A1、B2對卡那霉素消失的克隆進行鑒定。鑒定正確的菌種命名為E.coli(E)/Δirp2。

圖1 PCR鑒定引物所在位置Fig 1 Scheme of priming sites

1.2.4 HMWP2蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測 利用測序得到的irp2基因序列，通過ExPASy開發(fā)的在線工具Protparam分析HMWP2的理論分子量和等電點(pI)；登陸http://www.predictprotein.org/，對HMWP2二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；使用ExPASy開發(fā)的在線工具ProtScale分析HMWP2的親疏水性；使用ExPASy開發(fā)的在線工具TMpred分析HMWP2的可能的跨膜螺旋區(qū)，最優(yōu)拓撲結(jié)構(gòu)顯示有9個跨膜螺旋；使用ExPASy開發(fā)的在線工具SWISS-MODEL，與已知結(jié)構(gòu)的PDB數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進行比對，預(yù)測HMWP2的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1E.coliirp2基因的PCR擴增E.coli(A-E)及陰性對照的PCR擴增結(jié)果如圖2(M為2000 bp的DNA Marker；1為陰性對照，無條帶；2-6為E.coli(A-E)irp2基因PCR擴增條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致)。

圖2 E.coli中HPI irp2基因的PCR檢測Fig 2 PCR amplification of HPI irp2 gene of E.coli

2.2 打靶DNA片段的制備和純化 用于替換irp2基因的打靶片段兩端的同源序列分別為45 bp和50 bp，片段中間部分為兩側(cè)帶有FRT位點的卡那霉素(Kan)抗性基因，有利于重組子的篩選。純化回收的產(chǎn)物在高保真酶PCR擴增后經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，與目的片段的大小一致，見圖3(M為2000 bp的DNA Marker，1-3為同源重組DNA片段)。

圖3 融合PCR構(gòu)建的同源重組DNA片段Fig 3 DNA homologous recombination fragment builded by fusiohn PCR

2.3 質(zhì)粒pKD 46轉(zhuǎn)化E.coli(E)后的提取驗證 將pKD 46轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到E.coli(E)中，挑選單個菌落在Amp+ LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行電泳驗證，轉(zhuǎn)化的鑒定結(jié)果見圖4(M為2000 bp的DNA Marker，1-3為鑒定結(jié)果)：

圖4 質(zhì)粒pKD 46轉(zhuǎn)化的提取驗證Fig 4 Extraction and Verification of Plasmid pKD 46

2.4 電轉(zhuǎn)化后同源重組的鑒定 電轉(zhuǎn)化后irp2基因被Kan抗性基因片段替換后，如圖1所示，引物A1/A2、B1/B2和A1/B2分別用于擴增片段a、b、c。結(jié)果顯示，有3個片段的長度和預(yù)計的一樣(圖5)，說明Kmr基因已經(jīng)取代irp2基因，缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2構(gòu)建成功，正確重組率為10%。

圖5 irp2基因敲除的PCR驗證Fig 5 Verification of irp2 knockout by PCR

2.5 質(zhì)粒pCP 20轉(zhuǎn)化E.coli(E)/Kmr+/Δirp2后的提取驗證 將質(zhì)粒pCP 20轉(zhuǎn)化導(dǎo)入缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2，涂布于含Kan+和Amp+雙抗性LB平板上，30℃培養(yǎng)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，挑選單個菌落在Amp+ Kan+ LB液體培養(yǎng)基中進行擴增，提取質(zhì)粒后進行電泳驗證，轉(zhuǎn)化的鑒定結(jié)果見圖6(M為2000 bp的DNA Marker，1-3為目的基因)。

圖6 質(zhì)粒pCP 20轉(zhuǎn)化的提取驗證Fig 6 extraction and verification of plasmid pCP 20

2.6 卡那霉素抗性基因的消除鑒定 將成功轉(zhuǎn)化pCP 20的缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2接種于無抗性的LB液體培養(yǎng)基中，42 ℃下傳3～5代，再用卡那霉素抗性進行檢測，卡那霉素抗性在能夠穩(wěn)定遺傳的菌株中已經(jīng)消除，命名為E.coli(E)/Δirp2。用鑒定引物A1、B2進行驗證PCR和測序驗證，如圖7(M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-3：目的基因)。

圖7 卡那霉素抗性基因消除后PCR鑒定Fig 7 PCR analysis after kanamycin resistance gene eliminated

2.7 HPIirp2基因表達的蛋白的預(yù)測分析

2.7.1 HMWP2分子量及等電點的預(yù)測分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具Protparam分析HMWP2的理論分子量和等電點(pI)分別為：228826.60 Da，5.85。

2.7.2 HMWP2 二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析 登陸http://www.predictprotein.org/，對HMWP2二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，二級結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲所占的百分比分別為：43.5%、10.76%、46.19%，如圖8。

圖8 HMWP2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig 8 Prediction of HMWP2's Secondary Structure

2.7.3 HMWP2親疏水性分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具ProtScale分析HMWP2的親疏水性。結(jié)果顯示總平均疏水指數(shù)為：-0.221，為疏水性蛋白，如圖9。

圖9 HMWP2疏水性預(yù)測Fig 9 Prediction of HMWP2's Hydrophobicity

2.7.4 HMWP2跨膜區(qū)分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具TMpred分析HMWP2的可能的跨膜螺旋區(qū)，最優(yōu)拓撲結(jié)構(gòu)顯示有9個跨膜螺旋，如圖10。

圖10 HMWP2跨膜螺旋預(yù)測Fig 10 Prediction of HMWP2's Transmembrane Helices

2.7.5 HMWP2三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具SWISS-MODEL，與已知結(jié)構(gòu)的PDB數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進行比對，來預(yù)測HMWP2的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖11。

圖11 HMWP2三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig 11 Prediction of HMWP2's Tertiary Structure

3 討論與小結(jié)

1998年，Murphy[7]首次報道了將λ噬菌體的exo、bet、gam三個重組功能基因在質(zhì)粒上進行表達，從而利用λ噬菌體的Red功能在E.coli染色體上進行基因替換。與RecA同源重組體系相比，由于Red重組發(fā)生在細胞內(nèi)，E.coli的復(fù)制和修復(fù)系統(tǒng)保證了克隆的子代分子完全忠實于親代分子[8]。Red同源重組系統(tǒng)是由λ噬菌體的分別編碼Exo、Beta、Gam三種蛋白質(zhì)的exo、bet、gam三個基因組成的。Exo蛋白是一種單亞基分子量為24 kD的核酸外切酶，它的活性形式是一種環(huán)狀的三聚物分子，中間有一個一端能容納雙鏈DNA(dsDNA)，另一端能容納單鏈DNA(ssDNA)的中空通道[9]。Exo蛋白可以結(jié)合在dsDNA的末端，從雙鏈DNA從5'端向3'端降解，從而產(chǎn)生3'端突出。Beta蛋白是一種單亞基分子量為25.8 kD的退火蛋白，它可以通過自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)而結(jié)合到由Exo降解產(chǎn)生的ssDNA的3'突出端，從而促進ssDNA末端與互補鏈之間的退火，同時Beta蛋白還能防止單鏈核酸酶降解外源線性DNA[10]。Gam蛋白是Exo和Beta的輔助蛋白，功能是防止外源DNA片段被降解掉[11]。

目前用的最多的Red重組質(zhì)粒是Datsenko[12]構(gòu)建的具有高效重組能力的的低拷貝質(zhì)粒pKD 46。pKD 46在30℃培養(yǎng)時能夠正常地復(fù)制，當(dāng)溫度高于37 ℃時質(zhì)粒自動丟失，它含有溫敏型的復(fù)制起點oriR101和受ParaB啟動子調(diào)控的exo、bet、gam基因[13]，這三個基因攜帶氨芐青霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記，在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下表達。pKD 4在Red同源重組系統(tǒng)中作為抗性標(biāo)記使用，它含有卡那霉素抗性基因，以及在抗性基因的兩側(cè)有FRT位點。pCP 20同時含有氨芐青霉素和氯霉素抗性，且含有溫敏型的復(fù)制起點。pCP 20上還含有一個能產(chǎn)生與FRT位點結(jié)合的翻轉(zhuǎn)酶重組酶(Flipase Recombination Enzyme，F(xiàn)LP)的基因，從而使FRT位點發(fā)生自身同源重組，消除一個FRT位點和抗性基因。FLP重組酶可以在42 ℃時誘導(dǎo)表達，同時質(zhì)粒逐漸丟失[12,14]。

HPI是耶爾森菌的一個基因組，含有11個基因的功能核心區(qū)，攜帶的基因與鐵載體—耶爾森桿菌素的合成、調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運有關(guān)。其中，irp2基因為HPI的標(biāo)志基因，與攝鐵功能相關(guān)，該基因表達的HMWP2蛋白對Ybt的合成具有重要作用，被認為是Ybt陽性表型表達所必需。預(yù)測結(jié)果表明，HMWP2蛋白在pH為5.85時溶解度最小，易于析出。其中α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲所占的百分比分別為43.5%、10.76%和46.19%，HMWP2蛋白為疏水性跨膜蛋白。這些性質(zhì)可能與該蛋白的攝鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)。irp2作為鐵調(diào)節(jié)基因，僅在致病性耶爾森菌中表達，編碼的分子量為228 KD的HMWP2蛋白可參與Ybt的合成，誘導(dǎo)鼠疫菌素受體和Ybt表達，與耶爾森菌的鐵攝取能力有關(guān)。試驗利用Red同源重組的方法對irp2基因進行了敲除，并通過測序，對irp2基因表達的HMWP2蛋白進行了結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測，不僅為研究irp2基因在PEC致病機制中的作用及Red重組系統(tǒng)研究HPI的其他基因奠定了基礎(chǔ)，也為制備腸道感染病疫苗和粘膜免疫佐劑等提供了更多的理論依據(jù)。

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