茆安婷，尹玉偉，代 靜，郭曦堯，程 義，李 東，李月紅(吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118)

傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)，彈狀病毒科，諾拉彈狀病毒屬[1]，作為傳染性造血器官壞死病(infectious heamatopoietic necrosis，IHN)的病原體，是一種線性單鏈RNA病毒，最早在上世紀50年代在北美西部華盛頓及俄勒岡州于紅大馬哈魚(Oncorhynchus nerka)孵卵期的魚苗身上首次被發(fā)現[2]，并迅速蔓延到歐洲和亞洲，在全世界鮭鱒魚類中流行[3]。目前在對IHNV的防治措施主要有兩個方面，其一是抗病育種[4]，其二是通過對健康魚體進行早期的免疫接種，使機體免疫系統(tǒng)產生特異性免疫反應從而達到預防病毒的作用。而這兩種方法存在一定的不確定性，同時對魚類自身的健康及相關食品安全存在一定的隱患，雖然目前尚未有相關報道表明IHNV會直接影響人類的健康，但隨著病毒變異、魚機體的藥物殘留導致的食品安全問題可能會對人類的健康造成影響，所以尋找新型藥物迫在眉睫，目前在我國漁業(yè)養(yǎng)殖中，綠色、無公害、無耐藥性的新抗病毒中獸藥將逐步成為市場的主導。為尋找抗傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)的有效藥物，有文獻表明，習欠云等人[5]發(fā)現人參多糖復合物對對蝦肝臟中SOD超氧化物歧化酶活力有明顯提高效果，對于血清中PO和LSZ有類似作用；同時人參皂甙Rb1在體外細胞試驗中能夠滅活病毒[6]。為此試驗選取人參提取液對IHNV進行體外抑制方面的研究，為IHVN防治藥物的研發(fā)提供新的思路及參考。

1 材料與方法

1.1 材料 鯉魚腦細胞系(common carp brain, CCB)細胞培養(yǎng)液：M199固體培養(yǎng)基(北京Solarbio公司)溶解于蒸餾水中，0.22 μm過濾，加入10%體積胎牛血清和1%體積雙抗(青霉素-鏈霉素溶液100x，長春晶美生物)，4 ℃保存。

CCB細胞維持液：M199固體培養(yǎng)基溶解于蒸餾水中，0.22 μm過濾，4 ℃保存。

噻唑藍溶液(MTT溶液)∶50 mg噻唑藍(長春夢怡美生物科技有限公司)溶解于10 mL蒸餾水中，0.22 μm過濾，4 ℃保存。

人參提取液：將中藥人參片(購于吉林省長春市百草大藥房，參照中國藥典2005版附錄IX進行質量鑒定)運用水浴加熱法提取，再將提取得到的藥液通過水浴鍋濃縮得到浸膏，4 ℃保存[7-8]，使用時用蒸餾水溶解至飽和，0.22 μm過濾。

其他材料：上述常用試劑均為分析純，二甲基亞砜(DMSO)、胰酶消化液等購自長春夢怡美生物科技有限公司。CCB細胞、IHNV為實驗室保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒滴度測定 將CCB細胞接種于96孔板中，27 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h備用，將病毒懸液按照10-1-10-10做連續(xù)稀釋后按照100 μL/孔接種于長成單層細胞的96孔板中，每個濃度做8孔重復，梯度降溫至15 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，記錄每孔細胞病變情況，根據Reed-Muench法計算半數組織培養(yǎng)感染量(ICID50)[9]。

1.2.2 RTCA[10]實時監(jiān)控不同濃度人參提取液對IHNV的抑制作用 將CCB細胞以400個/孔的濃度接種于16孔E-Plate細胞增殖板內，5% CO2、27 ℃培養(yǎng)24 h后棄去細胞培養(yǎng)液，加入100 μL/孔病毒液感染CCB細胞，對照組加入無血清細胞維持液。5% CO2、15 ℃條件下孵育2 h后棄去病毒液，細胞維持液洗滌兩次后分別加入100 μL/孔2%、4%、8%人參提取液，每個濃度3孔重復，細胞對照加入無血清細胞維持液。將E-Plate細胞增殖板放回實時細胞分析儀內，設置每間隔15 min監(jiān)測并記錄CI值，繼續(xù)監(jiān)測72 h。后續(xù)實驗中所用人參提取液均為本步驟篩選出抑制效果最佳的人參提取液濃度。

1.2.3 人參提取液對IHNV的直接滅活作用 將人參提取液與病毒按照1∶1體積混合，27 ℃環(huán)境下分別作用30 min、1 h、2 h、4 h和8 h，加入到長成單層細胞的96孔板中，100 μL/孔，每時間點重復4孔[11]。梯度降溫至15 ℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。同時設置細胞對照組和病毒對照組。當病毒對照組CPE達80%左右時，記錄各孔CPE情況，MTT法測490 nm處OD值，計算人參提取液對IHNV的抑制率。

1.2.4 人參提取液對IHNV復制的阻斷作用 將毒力100TCID50的病毒液100 μL/孔接入長成單層細胞的96孔板中，梯度降溫至15 ℃。培養(yǎng)30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h，每時間點做4孔重復。達到培養(yǎng)時間后棄去病毒液，用細胞維持液洗滌2次。加入100 μL/孔的人參提取液，5%CO2，15 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。同時設置細胞對照和病毒對照。當病毒對照組CPE達80%左右時，記錄各孔CPE情況，MTT法測490 nm處OD值，計算人參提取液對IHNV復制阻斷的抑制率，評估人參提取液對IHNV復制的阻斷作用。

2 結 果

2.1 病毒滴度測定結果 測定結果見表1。由公式計算可得，病毒TCID50=10-5.6，即當稀釋度為10-5.6時，可使孔內50%的細胞發(fā)生病變。

表1 病毒滴度測定結果Tab 1 Results of virus titer test

2.2 RTCA實時監(jiān)控不同濃度人參提取液對IHNV的抑制效果 由圖1可知，根據RTCA實時無標記細胞功能分析儀檢測得到的細胞曲線，細胞接種24 h 期間各組細胞曲線均值穩(wěn)定上升，細胞生長狀態(tài)良好，加樣前無明顯停滯或下降趨勢。加入病毒液后，細胞經溫度和病毒的刺激增殖受到抑制，曲線驟降至同一水平。病毒吸附的4 h后細胞指數降低，顯示病毒開始明顯抑制CCB細胞生長，而細胞對照組仍成穩(wěn)定增長趨勢。從人參提取液對IHNV的抑制效果上，4%人參提取液對IHNV的抑制效果最佳，后期與細胞對照組細胞指數接近。而8%人參提取液在前期促進了細胞的生長，后期保護效果不佳。

圖1 不同濃度人參提取液對IHNV抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of ginseng extract with different concentrations on IHNV

2.3 人參提取液對IHNV的直接滅活作用結果 由表2可知，人參提取液對IHNV有直接滅活作用，5個時間點檢測抑制率最高達51.5%，但各個時間點間抑制率結果差異不顯著(P>0.05)。

表2 人參提取液對IHNV直接滅活抑制率結果Tab 2 Inhibitory effect of ginseng extract on direct inactivation of IHNV

抑制率結果一列數據右上角標注相同字母表示結果差異不顯著(P>0.05)

the results of the inhibition rate are shown in the upper right corner of the data. The results of the same letter are not significant (P>0.05)

2.4 人參提取液阻斷IHNV復制結果 由表3可知，IHNV先作用30 min～16 h后加入的人參提取液對病毒均具有復制抑制作用，病毒先作用1～4 h期間，人參提取液抗病毒作用明顯，抑制率接近60%。實驗期間人參提取液均表現出持續(xù)抑制作用，但30 min和16 h時抑制作用較其他時間點不明顯。

表3 人參提取液阻斷IHNV復制抑制率結果Tab 3 Ginseng extract was used to block IHNV replication inhibition rate

抑制率結果一列數據右上角標注相同字母，表示差異不顯著(P>0.05)，標注字母不相同表示差異顯著(P<0.05)

the result of inhibition rate is the same in the top right corner of the data, which means that the difference is not significant (P>0.05), and the letters are different, which means significant difference (P<0.05)

3 討論與小結

為了探討人參提取液體外抑制CCB細胞感染IHNV的能力，構建體外CCB細胞模型，運用RTCA技術和MTT法分別測得2%人參提取液、4%人參提取液和8%人參提取液對IHNV感染CCB細胞后抑制作用曲線，從阻斷病毒復制和殺滅病毒兩方面討論人參提取液作用效果。 研究表明，4%人參提取液對IHNV具有明顯抑制作用，能夠在一定時間內保護細胞不受IHNV病毒的侵染，2 h時對病毒滅活抑制率最高達到51.5%，1～12 h內對病毒復制有持續(xù)抑制作用，而8%人參提取液在前期促進了細胞的生長，后期保護效果不佳，對比說明人參提取液對IHNV的抑制不與劑量成依賴關系。

人參中含有Rg1、Rb1等30多種人參皂苷、α-人參烯等揮發(fā)油、人參酸等有機酸、人參黃酮苷等黃酮以及木脂素、甾醇、氨基酸、多糖等多種有益成分，其中人參皂苷及多糖等為主要有效成分[5]。而人參皂甙Rb1具有抗病毒的能力，在體外細胞試驗中能夠滅活病毒，使N蛋白表達下降從而起到抑制病毒復制的作用[6]。

由于目前IHNV增殖、復制和與宿主間相互作用的研究匱乏，試驗用RTCA實時無標記技術測得4%人參提取液對IHNV抑制作用明顯，較常見病毒CPE實驗省時省力，結果精確，避免了由于病毒在細胞內復制作用微弱導致空斑形成不明顯對試驗造成的誤差，實時監(jiān)測形成完整細胞效應圖譜，該技術已經應用于多項基于細胞的檢測，結果可信度較高[12-16]。MTT法在試驗過程中需將細胞液吸出，此過程可能導致細胞的流失影響試驗結果準確性，故采用加大重復試驗來避免誤差形成。而體外細胞試驗具有操作方面、靈敏、不易受外界因素干擾的優(yōu)點。

通過查閱大量文獻設定不同濃度的人參提取液作用于感染IHNV的CCB細胞，以探究人參提取液對IHNV的抑制作用及最適抑制濃度，為今后以人參作為防治IHNV的有效藥物奠定試驗基礎，同時為結合我國傳統(tǒng)中藥開發(fā)防治IHNV的新型藥物提供有效參考。

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