牛江婷，方 詞，伊淑帥，張 雙，何羽揚，董國英，胡桂學*(.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長春 308；.北京師范大學全球變化與地球系統(tǒng)科學研究院，北京 00875)

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabroncbispetica,Bb)與百日咳桿菌(Bordetellapertussis,Bp)、副百日咳桿菌(Bordetellaparapertussis,Bpp)同屬于波氏桿菌屬，是一種寄生在人、哺乳動物或家禽呼吸道上皮纖毛上的革蘭陰性短桿菌，感染后主要引起呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重者可導致急性死亡[1-2]。兔的波氏桿菌病是由兔支氣管敗血波氏桿菌(又稱為兔博德特氏桿菌)引起的一種以鼻炎、支氣管肺炎以及膿皰型肺炎為主要臨床癥狀的呼吸道傳染病，常與兔多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌以及鏈球菌混合感染，造成養(yǎng)殖場兔群的急性發(fā)病和大量死亡[3-4]。近年來，隨著集約化家兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及家兔引種與頻繁貿(mào)易，波氏桿菌在兔群中廣泛傳播，給家兔養(yǎng)殖帶來了巨大的經(jīng)濟損失。針對這一現(xiàn)象，抗生素類藥物作為強有效的預防及治療措施受到養(yǎng)殖戶的歡迎，但藥物的過量使用與濫用造成的耐藥性問題日益嚴重。因此，對地方或“自家”菌株進行耐藥性分析，對臨床合理用藥具有重要的指導意義。本試驗從內(nèi)蒙古海拉爾區(qū)某規(guī)模化兔場病死兔肺臟內(nèi)成功分離到一株細菌，經(jīng)鑒定為支氣管敗血波氏桿菌，并對其進行了藥物敏感試驗和部分耐藥基因檢測，以期為當?shù)赝脠霾ㄊ蠗U菌病的合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2017年4月，內(nèi)蒙古海拉爾區(qū)某規(guī)模化兔場2～4月齡兔群突然出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、咳嗽、打噴嚏、鼻分泌物增多等臨床癥狀，5～7 d后病兔大量死亡。對病死兔進行剖撿，肉眼觀察各組織器官，無菌采集肺臟、肝臟及心血，-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 綿羊鮮血瓊脂平板、TSA瓊脂平板購自南京一基生化科技有限公司；革蘭染色試劑盒、細菌微量生化鑒定管購自北京索萊寶科技有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit、Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；2×premix rTaq、pMD18-T Vector Cloning Kit、E.coliDH5α購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 主要儀器 MCO-18AIC恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、MCV131BNF超凈無菌工作臺(日本SANYO公司)、MikRo 22R高速冷凍離心機(德國HETTICH公司)、UV-2012PCS氣浴恒溫搖床(龍尼柯儀器有限公司)、g1000 PCR基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)、全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離純化 取無菌采集的病變組織，選擇新鮮創(chuàng)面分別于TSA、鮮血瓊脂平板上進行劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察病原菌生長狀態(tài)，挑取單一優(yōu)勢菌落繼續(xù)純培養(yǎng)。

1.2.2 染色、鏡檢 取少量分離菌純培養(yǎng)物涂片，進行革蘭染色，油鏡下觀察病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色特點。

1.2.3 生化試驗 將分離菌純培養(yǎng)物接種于含5%胎牛血清的液體LB培養(yǎng)基中，取少量菌液加入微量生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.4 PCR鑒定 使用細菌DNA提取試劑盒提取分離菌全基因組，分別采用16s rRNA通用引物與兔波氏桿菌鑒定引物[5]進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.5 藥物敏感性試驗 以Kirby-Bauer(K-B)氏法進行藥敏試驗，測量病原菌的抑菌環(huán)直徑，參考美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)提供的標準進行結(jié)果判定。

1.2.6 耐藥基因檢測 參照分離菌株藥物敏感性實驗結(jié)果，分別選取β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM[6]、blaCTX-M[6]，四環(huán)素類耐藥基因tetA[7]、tetB[7]，環(huán)胺類耐藥基因sul1[7]，氨基糖苷類耐藥基因aadA1[7]進行PCR檢測，對陽性擴增產(chǎn)物進行測序與基因比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離 病變組織經(jīng)平板劃線，于37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，鮮血瓊脂平板上呈現(xiàn)出表面光滑，邊緣整齊，中間稍隆起的灰白色圓形菌落，直徑約1 mm，周圍形成隱約可見的β-溶血環(huán)；在含5%胎牛血清的TSA培養(yǎng)基上形成致密、光滑、稍有凸起的黃白色菌落。

2.2 染色、鏡檢及形態(tài)觀察 經(jīng)革蘭染色后，油鏡下觀察該病原菌為兩極濃染，兩端鈍圓的革蘭陰性短桿菌，菌體大小均一，部分成對存在。

2.3 生化試驗 采用微量生化鑒定管對該株分離菌進行生化試驗，結(jié)果如表1所示。該菌不發(fā)酵蔗糖、乳糖、葡萄糖等糖類以及甘露醇等醇類；吲哚試驗、M-R、V-P試驗均呈陰性，不產(chǎn)生硫化氫；可利用枸櫞酸鹽，還原硝酸鹽，氧化酶、接觸酶、谷氨酸脫羧酶、脲酶反應(yīng)呈陽性；生化鑒定結(jié)果與《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》中波氏桿菌的描述一致，初步確定該分離菌株為波氏桿菌。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果Tab 1 Biochemical identification results of isolated strain

"+"表示陽性，"-"表示陰性。

"+" indicated positive, and "-" indicated negative.

2.4 PCR鑒定結(jié)果 16s rRNA通用引物擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小約為1500 bp的目的片段，與預期結(jié)果一致(圖1A)；支氣管敗血波氏桿菌鑒定引物擴增出大小約為425 bp的目的片段，與預期結(jié)果一致(圖1B)。測序結(jié)果經(jīng)Blast在線比對，與波氏桿菌同源性高達99.8%，確定該分離株為兔源支氣管敗血波氏桿菌。

2.5 藥物敏感性試驗 該分離菌藥敏試驗結(jié)果如表2所示。由表可知，該菌株對卡那霉素、慶大霉素、諾氟沙星、甲氧嘧啶高度敏感；對強力霉素、環(huán)丙沙星等中度敏感；對青霉素G、阿莫西林、頭孢拉啶、四環(huán)素等耐藥。

2.6 耐藥基因檢測 采用文獻中的引物檢測分離菌的6種耐藥基因，共篩選出blaTEM與tetB兩種耐藥基因，未檢測到blaCTX-M、tetA、sul1與aadA1耐藥基因的存在。圖2為耐藥基因blaTEM與tetB的檢測結(jié)果，分別于300 bp與350 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與目的擴增條帶305、374 bp一致。測序結(jié)果經(jīng)NCBI在線比對，與已發(fā)表的豬源支氣管敗血波氏桿菌、兔源波氏桿菌、肺炎克雷伯氏菌和沙門菌相關(guān)耐藥基因同源性為99.3%～99.9%。

A：16s rRNA通用引物擴增結(jié)果。M，DL200 DNA Maker；1，分離株菌液；2，分離株基因組DNA B：波氏桿菌鑒定引物擴增結(jié)果。M，DL200 DNA Maker；1，分離株基因組DNA；2，陰性對照A: Amplification results of 16s rRNA universal primers.M, DL200 DNA Maker; 1, bacteria liquid; 2, genome DNA of isolated strain B: Amplification results of Bb' appraisal primers.M, DL200 DNA Maker; 1, genome DNA of isolated strain; 2, negative control圖1 PCR擴增電泳圖Fig 1 Amplification electrophoresis of PCR

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果Tab 2 Drug sensitive test results of isolated strain

M：DL200 DNA Maker；1：blaTEM基因(305 bp)；2，tetB基因(374 bp)M:DL200 DNA Maker;1:blaTEM gene (305 bp);2:tetB gene (374 bp)圖2 耐藥基因檢測電泳圖Fig 2 Tested electrophoresis of resistance gene

3 討論與小結(jié)

兔細菌性呼吸系統(tǒng)疾病的病原主要包括支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌與鏈球菌等。其中，波氏桿菌與巴氏桿菌是規(guī)?；脠龆喟l(fā)的呼吸道病原菌，?；旌细腥荆斐赏萌旱闹夤芊窝着c膿皰型肺炎，導致兔群急性死亡，制約兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。由于波氏桿菌與巴氏桿菌在培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)以及生化特點等方面具有很大的相似性，給臨床診斷工作造成了極大地困難。實驗從發(fā)病兔群肺臟中成功分離到一株細菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察、革蘭染色、生化鑒定以及PCR鑒定確定為支氣管敗血波氏桿菌。為了解該兔場所在地區(qū)兔波氏桿菌的耐藥情況，對該分離株進行了藥物敏感性試驗與耐藥基因檢測。藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，該分離菌株對β-內(nèi)酰胺類與四環(huán)素類抗生素的耐藥最為嚴重，其中對青霉素G、阿莫西林、頭孢拉啶完全耐藥，對氨基糖苷類與喹諾酮類抗生素高度敏感(表2)。該分離菌株的耐藥情況與以往報道的結(jié)果存在相似性，但是也存在不同。王曉芳等[6]對分離自浙江省的22株兔支氣管敗血波氏桿菌耐藥情況進行了分析，分離菌株對林克酰胺類與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥嚴重，耐藥率達到91.0%～100%，對青霉素、頭孢拉啶、林可霉素的耐藥最為嚴重，但是，對四環(huán)素類、喹諾酮類與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素高度敏感。李長安等[8]對陜西某兔場波氏桿菌分離株耐藥性進行了分析，結(jié)果顯示分離菌株對環(huán)丙沙星、恩諾沙星等抗生素高度敏感，對紅霉素、四環(huán)素等抗生素耐藥。馬增暉，王孝友等[9-10]研究結(jié)果均表明兔波氏桿菌對卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星高度敏感。由于不同地區(qū)流行毒株與抗生素使用情況的差異，導致波氏桿菌地區(qū)分離株耐藥性存在著差異，但綜合近年來波氏桿菌耐藥性研究結(jié)果，波氏桿菌普遍對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，對氨基糖苷類與喹諾酮類抗生素高度敏感。這一結(jié)果對兔場波氏桿菌病的臨床用藥具有指導意義。

耐藥性基因檢測結(jié)果顯示，該分離菌株攜帶有β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM與四環(huán)素類耐藥基因tetB，耐藥基因檢測結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果一致。細菌產(chǎn)生的TEM性β-內(nèi)酰胺酶是介導細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因，編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因主要由質(zhì)粒攜帶，并可通過質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導與接合等方式轉(zhuǎn)移給其他非耐藥菌，造成耐藥菌株的普遍存在[11-12]。王曉芳等[6]檢測到blaTEM耐藥基因在兔源波氏桿菌內(nèi)廣泛存在，與研究結(jié)果一致。blaTEM耐藥基因的廣泛存在解釋了兔波氏桿菌對青霉素G、阿莫西林、頭孢拉啶等β-內(nèi)酰胺類抗生素普遍耐藥的現(xiàn)象。該分離株檢測到tetB耐藥基因，并對四環(huán)素類耐藥，可能是當?shù)赝脠龃罅渴褂盟沫h(huán)素類抗生素造成菌株變異，產(chǎn)生對四環(huán)素類抗生素的耐藥性。

伴隨著兔養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，抗生素的使用量也會大量增長，隨之而來的細菌耐藥現(xiàn)象也應(yīng)受到廣泛重視。兔波氏桿菌作為一種潛在的人畜共患病原菌，耐藥菌株的出現(xiàn)不僅會制約兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，也會對人類健康造成巨大威脅。因此，了解地方菌株的耐藥情況與耐藥基因攜帶情況，可為臨床上抗生素的合理使用提供參考，也可以盡量減少耐藥菌株的出現(xiàn)，對公共生物安全具有重要意義。

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