吳 丹，梁 浩

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種以腹痛、腹瀉及膿血便等為臨床表現(xiàn)，直腸結(jié)腸黏膜及黏膜下層[1]為病變部位的慢性非特異性腸病。我國(guó)的UC患病率達(dá)11. 6/10萬(wàn)，且多發(fā)于10～30歲的年輕人群。目前主要認(rèn)為UC發(fā)病誘因?yàn)檫z傳基因易感性、免疫損傷和環(huán)境因素等導(dǎo)致的腸道黏膜炎癥反應(yīng)[2]。UC在西醫(yī)治療上缺乏特殊方法，而針刺天樞穴治療UC療效確切、見(jiàn)效快[3]，但作用機(jī)制仍需探討。本實(shí)驗(yàn)意圖通過(guò)電針天樞穴觀察UC模型大鼠血清炎性因子及腸黏膜NF-κB p65的變化，探討電針天樞穴對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎部分作用機(jī)制，為電針天樞穴治療UC的機(jī)理提供依據(jù)，并為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，3月齡，清潔級(jí)。飼養(yǎng)環(huán)境：安靜環(huán)境下飼養(yǎng)7天，室溫(24±3)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，自然光線(xiàn)，自由飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

G6805-A電針儀(廣東汕頭醫(yī)療器械廠生產(chǎn))；醫(yī)用低溫箱(中科美菱，DWYL270)；低溫高速離心儀(BeckMAN，CoulTER，A99471)；凝膠成像系統(tǒng)(將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，Tanon-2500)；微量光吸收儀(Implew，P330)；酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO，瑞士TECAN公司)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche，light cycler-480)。

1.3 試劑

2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS,Sigma公司)；大鼠TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA測(cè)試盒(賽默飛世爾科技有限公司)；NF-κB p65轉(zhuǎn)錄因子試劑盒(Cayman公司)；其他試劑由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

60只SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組和電針組，每組各20只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)操作均符合黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

2.2 UC大鼠模型制備

實(shí)驗(yàn)前模型組及電針組大鼠術(shù)前禁食、不禁水24 h。烏拉坦腹腔注射麻醉動(dòng)物后，將一直徑2 mm、長(zhǎng)12 cm的橡膠管由肛門(mén)輕輕送入深約8 cm處，并將含150 mg/kg TNBS的50%乙醇溶液緩慢推入結(jié)腸，后將大鼠尾巴提起，持續(xù)倒置1 min[4-5]?？瞻捉M動(dòng)物推入相同容量的生理鹽水。

2.3 針刺方法

造模成功后第2天將電針組大鼠固定于固定器上，直刺雙側(cè)天樞穴(嚴(yán)格按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]的方法取穴，天樞穴定位：相當(dāng)于臍中旁開(kāi)5 mm)，進(jìn)針5 mm，捻轉(zhuǎn)有緊滯感后針柄接電針,以肌肉或針柄微顫為度，共20 min，1次/天，共30天?？瞻捉M和模型組動(dòng)物在每天同一時(shí)間亦放置在固定器上固定20 min，但不針刺。

2.4 樣本采集與處理

治療結(jié)束后大鼠禁食24 h，用25%烏拉坦(按0.5 mL/100 g)麻醉，腹主動(dòng)脈采血后處死。血液2 mL置于離心機(jī)4℃、3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，血清分離-70℃保存。解剖大鼠留取距肛門(mén)約8 cm結(jié)腸組織，沿腸系膜縱行切開(kāi)，以冰生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，光鏡下肉眼參照Luk等[7]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(Colonmucosa damage index，CMDI)評(píng)分。

2.5 指標(biāo)觀察

2.5.1 潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI) 根據(jù)粘連程度(0～2分)和炎癥、潰瘍形成情況(0～8分)進(jìn)行結(jié)腸黏膜大體形態(tài)損傷評(píng)分。

2.5.2 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分 各組大鼠取結(jié)腸病變處約1 cm組織，并用甲醛固定24 h，后脫水、浸蠟、包埋，切片機(jī)切片后蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察并參照Copper等[8]評(píng)分方法進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分(Histopathological score，HPS)。

2.5.3 細(xì)胞因子含量 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)細(xì)胞因子含量。取每只大鼠結(jié)腸組織100 mg，加入裂解液，勻漿至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)固體。勻漿液以4 ℃、1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取上清，置于-20℃保存待檢。檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)處理后測(cè)定吸光度，即OD值。繪制曲線(xiàn)并計(jì)算IL-1、IL-6、TNF-α的含量。

2.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按試劑盒說(shuō)明提取結(jié)腸黏膜組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NF-κB p65基因，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)Gene Bank確認(rèn)無(wú)誤后，以GAPDH作為內(nèi)參，合成Δ引物。mRNA引物:上游引物：5′-CTGACCTGAGCCTTCTGGAC-3′,下游引物：5′-GGAG GCTATTG CTCATCACA -3′反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增條件:95℃30 s,95℃5 s,60℃30 s，循環(huán)40次。以Ct法行PCR產(chǎn)物相對(duì)定量分析，方法:記錄各樣本對(duì)應(yīng)的Ct值，并按公式計(jì)算，公式為：Ct=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH基因)，各組2-ΔΔct，最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)=實(shí)驗(yàn)組2-ΔΔct值/對(duì)照組22-ΔΔct值(Ct為熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù))。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況

造模后模型組大鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少，食欲下降，精神萎靡，膿血便甚至黑便，大便形狀成扁橢圓形，持續(xù)至取材當(dāng)天。經(jīng)電針天樞穴治療后，大鼠膿血便逐漸減少，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤。

3.2 UC大鼠腸黏膜損傷指數(shù)及病理評(píng)分的變化

空白組大鼠結(jié)腸黏膜光滑，未見(jiàn)潰瘍及炎癥反應(yīng)，上皮結(jié)構(gòu)完整，隱窩無(wú)壞死，黏膜固有層及黏膜下層無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且黏膜下層無(wú)充血、水腫；模型組大鼠結(jié)腸可見(jiàn)管壁增厚，黏膜充血水腫，可見(jiàn)糜爛、潰瘍及炎性分泌物，黏膜層隱窩全層壞死，表面形成潰瘍，病變累及腸壁各層，與空白組比較P<0. 01；電針組大鼠結(jié)腸黏膜充血水腫、糜爛及潰瘍，可見(jiàn)腺體及杯狀細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與模型組比較P<0.01。見(jiàn)表1、封三彩圖1。

表1 各組大鼠腸黏膜損傷指數(shù)及病理評(píng)分的比較分)

注：與空白組比較，○P<0.05，○○P<0.01；與模型組比較，●P<0.05，●●P<0.01

3.3 UC大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量變化

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α明顯升高(P<0.01);與模型組比較，電針組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量的比較

注：與空白組比較，○P<0.05，○○P<0.01；與模型組比較，●P<0.05，●●P<0.01

3.4 UC大鼠NF-κB p65 mRNA表達(dá)的變化

與空白組比較，模型組大鼠NF-κB p65 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組比較，電針組大鼠NF-κB p65 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組UC大鼠NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較

注：與空白組比較，○P<0.05，○○P<0.01；與模型組比較，●P<0.05，●●P<0.01

4 討論

天樞穴屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，以治療泄瀉、痢疾、腹脹、腹痛、便秘、腸鳴和繞臍痛等為主，如《千金方》云:“……大便泄數(shù)，并灸天樞”，《針灸大全》記載：“泄瀉不止,里急后重:天樞二穴”,《針灸聚英》云：“天樞理感患脾泄之?！?《針灸大成》載：“脾泄之癥別無(wú)他,天樞二穴刺休差”。研究表明天樞穴擅治消化系統(tǒng)疾病，具有刺激易傳入的特點(diǎn)及調(diào)節(jié)腸道的蠕動(dòng)、吸收和分泌等功能。

而炎性反應(yīng)的誘發(fā)、持續(xù)和擴(kuò)大可被看做為潰瘍性結(jié)腸炎的可能發(fā)病機(jī)制，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞積聚在被損害部位，并產(chǎn)生炎性介質(zhì)[9]，這些物質(zhì)擴(kuò)大免疫反應(yīng)并介導(dǎo)組織損傷，從而造成腸道的生理功能紊亂。研究顯示，介導(dǎo)UC發(fā)病的細(xì)胞因子被認(rèn)為是IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)等促炎癥細(xì)胞因子。腫瘤壞死因子(TNF)主要由激活的單核細(xì)胞產(chǎn)生，并在介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)中有重要作用，是多種生物活性較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)劑及促炎細(xì)胞因子。而NF-κB等核轉(zhuǎn)錄因子的激活及其他炎性因子的釋放可源于炎性反應(yīng)刺激誘導(dǎo)的TNF-α分泌[10]。IL-1是具有激活T、B細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞[11]等活化及誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)等多種功能的一種細(xì)胞因子。IL-1可刺激IL-6、TNF-α等其他的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，而本身并不導(dǎo)致組織損傷。而IL-6是可促進(jìn)Tc細(xì)胞及NK細(xì)胞溶解細(xì)胞的功能、介導(dǎo)免疫球蛋白分泌的由單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子[12]。本實(shí)驗(yàn)中UC模型大鼠結(jié)腸內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-6的含量明顯升高，而電針治療能降低其含量,說(shuō)明電針天樞穴可以抑制腸道炎癥反應(yīng)。

UC黏膜在IL-1、IL-6及TNF-α活化的同時(shí)常伴NF-κB活性增高，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB進(jìn)一步活化，后者通過(guò)正反饋進(jìn)一步增加IL-1及TNF-α的分泌，IL-6的表達(dá)也增加，進(jìn)而炎癥過(guò)程得以放大和持續(xù)。NF-κB是一種參與調(diào)節(jié)多種炎癥過(guò)程和免疫基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等的釋放參與UC腸道的炎性及免疫反應(yīng)的過(guò)程。同時(shí)NF-κB又發(fā)揮保護(hù)及損害的雙向作用，既可維持腸黏膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，又可介導(dǎo)病原特異性應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)UC患者病變結(jié)腸黏膜組織NF-κB表達(dá)水平明顯增高，同時(shí)與病情活動(dòng)性和嚴(yán)重性緊密相關(guān)，因此NF-κB表達(dá)水平對(duì)于病情評(píng)估和治療效果判斷有一定指導(dǎo)意義[13]。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究，TNBS乙醇溶液灌腸后可造成腸黏膜層和黏膜下層的急性損傷，且大鼠腸黏膜的NF-κB p65 mRNA表達(dá)升高。而本研究中治療方法電針天樞穴可下調(diào)大鼠腸黏膜NF-κB p65 mRNA的表達(dá)，同時(shí)具有改善UC炎癥狀態(tài)及免疫應(yīng)答的作用。

綜上本研究中UC大鼠的細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及腸黏膜內(nèi)的NF-κB表達(dá)經(jīng)電針天樞穴治療后受到明顯抑制，表明電針天樞穴可能是通過(guò)抑制TNF-α、IL-1、IL-6及NF-κB的表達(dá)起到治療UC效果，進(jìn)而明確電針天樞穴對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κB信號(hào)通路影響。

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