司洪陽， 杜 紅， 郝學(xué)政， 趙秀香， 吳元華

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，遼寧沈陽 110161)

嘧肽·多抗水劑是由生物農(nóng)藥嘧肽霉素[1]和多抗霉素復(fù)配而成的新型農(nóng)用抗生素，已獲農(nóng)藥臨時登記，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，能夠耐高溫、酸堿和陽光照射，且無毒無害，對大多數(shù)植物真菌病害均有一定的防治作用。煙草靶斑病是近幾年我國煙草上發(fā)現(xiàn)的一種新病害，主要由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起[2-3]。煙草靶斑病主要危害煙草葉片，在苗期至大田成熟期均可發(fā)生，一旦發(fā)生迅速蔓延，造成煙葉質(zhì)量和產(chǎn)量降低[4]，已成為影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害之一。目前，尚未發(fā)現(xiàn)較好的抗病品種，藥劑防治依然是控制煙草靶斑病的主要手段[5]。本試驗研究1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌的抑菌方式和作用機制，以期為煙草靶斑病的田間防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌為煙草靶斑病病菌(RhizoctoniasolaniKühn)，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院提供。

供試藥劑為1.8%嘧肽·多抗水劑，由沈陽紅旗林藥有限公司提供。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g 瓊脂粉、1 L蒸餾水；PD培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 L蒸餾水。

供試試劑盒：真菌DNA提取試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲生長的抑制作用 采用含藥培養(yǎng)基法測定煙草靶斑病病菌的抑菌活性，將定量的PDA培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至45 ℃左右，分別加入不同濃度的1.8%嘧肽·多抗水劑，使其終濃度分別為5.63、11.25、22.50、45.00、90.00 mg/L，并以不加藥劑作為對照，充分混勻，倒入培養(yǎng)皿中，制成含藥培養(yǎng)基。

用打孔器制取直徑為6 mm的菌餅，將菌絲面朝下接種在PDA平板中間位置，每組設(shè)置3個重復(fù)，將培養(yǎng)皿放入 28 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)，直至菌絲長滿培養(yǎng)皿后，用十字交叉法測量菌落直徑，并用下列公式計算出菌絲生長抑制率：

1.2.2 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲形態(tài)的影響 制備煙草靶斑病病菌的菌絲懸浮液，移入含定量PD培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后加入一定量嘧肽·多抗水劑使其終濃度為90.00 mg/L，并于藥劑處理4、8、12、16、24 h后進行取樣，在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化。

1.2.3 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲細(xì)胞膜滲透性的影響 將制備好的菌懸液倒入定量的PD培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h，分別加入1.8%嘧肽·多抗水劑，使其終濃度為11.25、45.00、90.00 mg/L，每個處理3次重復(fù)，并以不加藥劑的處理作為對照。加入藥劑后，立即取出5 mL培養(yǎng)液，用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率，剩下的菌懸液繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別于4、8、12、20、24 h后取出培養(yǎng)液，離心處理后留上清液測其電導(dǎo)率[6]。

1.2.4 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲麥角甾醇含量的影響 參考單慰曾等的方法[7]，制備菌絲懸浮液后倒入PD培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h后分別加入嘧肽·多抗藥劑，使其終濃度分別為1.25、22.50、45.00、90.00 mg/L，每個處理3次重復(fù)，并以不加藥劑的處理作為對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用紗布過濾，磷酸緩沖液清洗各處理菌絲3次，取出后放入離心管中，6 000 r/min離心收集菌絲體。各處理分別取2.5 g濕菌絲，加入甲醇和三氯甲烷(體積比為2 ∶1)混合液，研磨至勻漿后室溫靜置1 h，依次加入水、三氯甲烷和磷酸緩沖液各5 mL，待分層后取三氯甲烷相，水浴蒸干。加入甲醇和乙醇(體積比為4 ∶1)混合液，60 ℃皂化1 h，加入水和石油醚各4 mL，取石油醚層蒸干，用乙醇溶液溶解干物質(zhì)，定容至 3 mL，用分光光度計在282 nm處測定其吸光度(D282 nm)，由吸光度可求出菌絲麥角甾醇含量的變化(x)，公式如下：

1.2.5 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲脂質(zhì)過氧化的影響 收集菌絲體的方法同“1.2.4”節(jié)，PD液體培養(yǎng)基留存待用。稱取2.0 g濕菌絲體，加液氮研磨至粉末狀，加入 4 mL 巴比妥酸和三氯乙酸混合液(1.5 g 2-硫代巴比妥酸溶于30 mL三氯乙酸，蒸餾水定容至150 mL)，溶解菌絲體內(nèi)產(chǎn)生的丙二醛，12 000 r/min離心，取上清液轉(zhuǎn)移到試管中，沸水處理使丙二醛與巴比妥酸產(chǎn)生顯色反應(yīng)。冰浴冷卻后 12 000 r/min 再次離心，取上清液待測。同時，將液體培養(yǎng)基與巴比妥酸和三氯乙酸的混合液按體積比5 ∶2混合，分別測定各處理樣品在450、532、600 nm處的吸光度[8]，并按以下公式計算丙二醛(MDA)的濃度(CMDA)：

CMDA=6.45(D532 nm-D600 nm)-0.56D450 nm。

1.2.6 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的影響 取各濃度嘧肽·多抗藥劑處理后的菌絲，用濾紙吸干菌絲表面的水分，然后放入烘箱中，溫度設(shè)置為40～50 ℃，每5 min觀察1次，當(dāng)菌絲水分蒸干即可取出；加入液氮研磨，磨碎成粉末后，倒入離心管中，使菌絲量在離心管0.5 mL刻度處。菌絲準(zhǔn)備完畢后，采用真菌DNA提取試劑盒提取DNA，按照試劑盒具體步驟進行操作，最后將提取到的DNA收集到離心管中，測定DNA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲生長的抑制作用

由圖1可知，1.8%嘧肽·多抗水劑處理過的培養(yǎng)基中，隨著藥劑濃度的增大，病原菌菌落直徑不斷減小，菌絲生長也較為稀疏。經(jīng)22.50～90.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理后，煙草靶斑病病菌菌絲不能正常生長，抑制率可達(dá)100%，經(jīng)11.25、5.63 mg/L嘧肽·多抗處理后，煙草靶斑病病菌菌絲略有生長，但菌落顏色較淺，5.63 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑對菌絲生長的抑制率達(dá)40%。結(jié)果表明，1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲表現(xiàn)出較強的抑制作用。

2.2 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲形態(tài)的影響

經(jīng)90.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理4 h后，菌絲開始發(fā)生變化，部分菌絲原生質(zhì)凝聚并收縮(圖2-a)，8 h后菌絲出現(xiàn)畸形，原生質(zhì)大量外滲，菌絲分枝不明顯，菌絲斷裂情況加重；而對照菌絲生長旺盛，未見原生質(zhì)外滲，伸展力強，菌絲分隔明顯(圖2-b)。結(jié)果表明，1.8%嘧肽·多抗水劑可以通過破壞煙草靶斑病病菌的菌絲而達(dá)到抑制菌絲生長的作用。

2.3 1.8%嘧肽·多抗對煙草靶斑病病菌菌絲細(xì)胞膜滲透性的影響

電導(dǎo)率是病原菌菌絲細(xì)胞膜破壞程度的指標(biāo)，電導(dǎo)率數(shù)值越大，說明細(xì)胞膜透性越大，細(xì)胞膜的破壞程度越嚴(yán)重。由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著處理時間的延長和1.8%嘧肽·多抗水劑濃度的增加均會使電導(dǎo)率變大。加入藥劑后立即取出培養(yǎng)液進行測定，不同濃度的1.8%嘧肽·多抗水劑藥劑處理的菌絲與對照菌絲差異不明顯，電導(dǎo)率在1.41～1.45 μS/cm 之間；隨著處理時間的延長，各濃度處理的電導(dǎo)率均明顯增加，高濃度處理的電導(dǎo)率明顯比低濃度處理的電導(dǎo)率高，電導(dǎo)率增加的幅度從20 h后變化不明顯，由此推測，此時病原真菌菌絲細(xì)胞膜已被完全破壞。

2.4 1.8%嘧肽·多抗對煙草靶斑病病菌菌絲麥角甾醇含量的影響

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分，它在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、膜結(jié)合酶的活性、膜的流動性、細(xì)胞活力及物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔谩Ｔ囼灲Y(jié)果表明，在對照培養(yǎng)液中生長的煙草靶斑病病菌菌絲麥角甾醇含量與加入不同濃度1.8%嘧肽·多抗藥劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的菌絲麥角甾醇含量差別不大，由此可知，1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲中麥角甾醇的含量無明顯影響。

2.5 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲脂質(zhì)過氧化的影響

丙二醛是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可表示脂質(zhì)過氧化的程度，反映出膜損壞的程度。由表1可知，在對照處理中，丙二醛的總濃度為0.088 7 μmol/L，經(jīng)過濃度為11.25 mg/L的1.8%嘧肽·多抗水劑處理后丙二醛的總濃度為 0.132 5 μmol/L，且隨著1.8%嘧肽·多抗水劑濃度的增加，煙草靶斑病病菌菌絲體內(nèi)丙二醛的含量逐漸升高，即細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度加劇。

表1 不同濃度1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病 病菌菌絲丙二醛(MDA)的影響

2.6 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的影響

由表2可知，經(jīng)45.00、22.50、11.25 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的煙草靶斑病病菌菌絲DNA的含量有明顯變化。在45.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的情況下，DNA合成抑制率為54.20%；在22.50 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的情況下，DNA合成抑制率為46.35%；在 11.25 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的情況下，DNA合成抑制率為34.12%。由此可知，1.8%嘧肽·多抗水劑可以在DNA水平上抑制菌絲生長。

表2 不同濃度1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病 病菌菌絲DNA含量的影響

3 結(jié)論與討論

本研究的結(jié)果表明，1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌具有良好的抑制作用，45.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑能夠有效抑制煙草靶斑病病菌菌絲生長，抑制率達(dá)到100%；5.63 mg/L 1.8%嘧肽·多抗對菌絲生長的抑制率也可達(dá)40%；同時，煙草靶斑病病菌經(jīng)過1.8%嘧肽·多抗處理后，菌絲出現(xiàn)畸形，原生質(zhì)大量外滲，菌絲分枝不明顯，菌絲斷裂。1.8%嘧肽·多抗能夠使煙草靶斑病病菌菌絲體電解質(zhì)外滲，影響細(xì)胞膜透性的變化，且對煙草靶斑病病菌菌絲在相同處理時間內(nèi)，隨著1.8%嘧肽·多抗水劑濃度的增加，電導(dǎo)率逐漸升高；在同一處理濃度下，在一定范圍內(nèi)處理時間越長，電導(dǎo)率越大，對細(xì)胞膜的破壞程度越嚴(yán)重。1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲細(xì)胞膜麥角甾醇含量無明顯影響，但能夠使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，釋放出丙二醛，且1.8%嘧肽·多抗水劑的濃度越大，丙二醛的含量越高。1.8%嘧肽·多抗水劑能夠抑制煙草靶斑病病菌菌絲DNA的合成，45.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的抑制率為54.20%，11.25 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的抑制率為34.12%。

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