金 海， 趙拴平， 徐 磊， 賈玉立， 賈玉堂*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省潁上牛哥牧業(yè)科技有限公司，安徽 潁上 236200)

肉牛飼養(yǎng)中，配后未孕確診的時間越早，越有利于縮短配種間隔，減少空懷時間，提高牛群受胎率，降低飼養(yǎng)成本。而母牛體內(nèi)相關(guān)生殖激素及水平能反映出自身妊娠狀態(tài)，比如孕激素，主要成分為孕酮(P4)，與雌激素共同調(diào)節(jié)雌性動物發(fā)情與妊娠，動物妊娠后P4一直維持在較高水平。妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)是反芻動物胎兒胎盤的滋養(yǎng)層雙核細胞在母體子宮上皮細胞融合時釋放的物質(zhì)，檢測血液中PAG逐漸成為國際主流的牛早期妊娠診斷方法[1]。早孕因子(EPF)是由Morton等在小鼠受精6 h后的血清中首次發(fā)現(xiàn)，此后在妊娠豬、牛、羊等哺乳動物母體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)，是確認妊娠的標志之一[2]。近年來，研究配后母體內(nèi)激素含量變化是一種新穎、前沿的早期妊娠診斷技術(shù)，奶牛[3]、牦牛[4]、水牛[5]、羊[6]、熊貓[7]、獼猴[8]等動物上均有報道，但目前仍處于研究階段，未見成熟上市產(chǎn)品及推廣。激素的種類及判定標準也在不斷完善和豐富。

試驗通過酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒檢測肉牛配種后的不同天數(shù)中，血液、尿液中P4、PAG和EPF濃度變化，用于對比母牛妊娠與非妊娠、血液與尿液中的差異，為今后尿液作為早期妊娠診斷媒介的可能性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本選擇及分組

選擇潁上牛哥牧業(yè)科技有限公司大別山資源場內(nèi)的安—大雜交牛F1代(安格斯♂×大別山♀)作為試驗牛，隨機選擇膘情適中，繁殖機能正常，發(fā)情明顯的F1代7頭。圈養(yǎng)在同一欄(欄面積約80 cm2)，一天兩餐，飲水充足，每天清掃1次欄舍。每頭牛喂青貯飼料20～30 kg/d，精料2～3 kg/d。

爬跨或接受爬跨，且陰道有粘液流出的母牛視為發(fā)情。7頭試驗牛發(fā)情表現(xiàn)均明顯，其中5頭配種后均未返情，視為懷孕(試驗組);另外2頭在配種后21 d返情，視為未孕(對照組)。

1.2 采樣及樣品處理

牛發(fā)情并配種的當天記為第0天，在第0、1、8、17、21、28、35 天(共7次)分別采集血、尿液各5 mL。綁定架固定好牛后，采用紅頭真空采血管(不添加任何添加劑)頸靜脈采血，等牛排尿時，直接用10 mL離心管收集尿液。

采集的血液4 ℃靜置1 h，離心機3 000 r/min離心30 min，收集血清，分裝標號。處理后的血樣、尿樣-20 ℃冷凍保存。

1.3 激素檢測

用ELISA試劑盒檢測試驗組與對照組在不同時間內(nèi)血、尿中激素(P4、PAG、EPF)的含量變化，ELISA試劑盒購買于江蘇酶標生物科技有限公司。按照試劑盒說明書操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，LSD法進行多重比較。以P<0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠初期血、尿中孕酮(P4)濃度變化

由表1可知，0～35 d，試驗組與對照組血、尿液中P4濃度無明顯變化。同一組別中，血液濃度高于尿液的。同一樣品中，試驗組濃度高于對照組。試驗組血液中P4含量與對照組在第0/17/21/35天差異顯著(P<0.05)，在第8天差異極顯著(P<0.01)。試驗組尿液中P4含量與對照組在第1天，差異顯著(P<0.05)，在第5天差異極顯著(P<0.01)。

2.2 妊娠初期血、尿中妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)濃度變化

由表2可知，0～35 d，試驗組與對照組血、尿液中PAG濃度變化平穩(wěn)。同一樣品中，對照組濃度高于試驗組。同一組別中，血液中的濃度高于尿液。試驗組與對照組血、尿液中，PAG濃度均先升高后下降。血液中，第8～17天濃度較高，隨后下降。尿液中，第8天達到小高峰，隨后濃度下降，第28天后又逐漸上升。血液中PAG濃度，對照組與試驗組在第8/21天差異顯著(P<0.05)，第28天極顯著(P<0.01)；尿液中PAG濃度，對照組與試驗組在第21/28天差異顯著(P<0.05)。

表1 妊娠初期血液與尿液中P4檢測結(jié)果 pmol/L

注：*表示對照組與試驗組差異顯著(P<0.05)；**表示對照組與試驗組差異極顯著(P<0.01)。下同。

表2 妊娠初期血液與尿液中PAG檢測結(jié)果 ng/L

2.3 妊娠初期血、尿中早孕因子(EPF)濃度

由表3可知，母牛配后0～35 d里，血液、尿液中EPF濃度變化平穩(wěn)。但試驗組濃度高于對照組，血液中的高于尿液。比較同一天里的試驗組與對照組濃度差異可知，血液中試驗組與對照組濃度差異值較大，在第8/17/21天，有顯著差異(P<0.05)。尿液則濃度差異值較小，在第28天，有顯著差異(P<0.05)。

表3 妊娠初期血液與尿液中牛EPF檢測結(jié)果 ng/L

4 討 論

4.1 P4作為牛妊娠診斷的依據(jù)

理論上認為，母牛在發(fā)情至配后第5天前，P4濃度較低且無明顯升高，自此之后明顯增長，直到第16天左右，體內(nèi)P4會逐漸增加，若妊娠，則維持在較高水平，安宮保胎。有研究表明，湘西黃牛發(fā)情當天血液中P4濃度(0.36 ng/mL)較低，第12天達到峰值(14.85 ng/mL)[9]。草原紅牛、延邊黃牛、西門塔爾在發(fā)情當天和配種后1 d內(nèi)，血清中P4含量(約1 ng/mL左右)很低，第8天含量升高，直至第17天，孕牛與非孕牛P4含量出現(xiàn)顯著性差異，孕牛持續(xù)維持在較高水平，非孕牛則開始下降。3個品種配后第21天的P4含量，以孕牛均高于未孕牛，差異極顯著[10]。而本次試驗中，無論是試驗組與對照組，還是血液與尿液中，整個妊娠初期P4均沒有出現(xiàn)明顯的高低濃度波動，甚至血液試驗組在第8～21天含量呈下降趨勢。具體原因有待進一步研究。

4.2 PAG作為牛妊娠診斷的依據(jù)

PAG是反芻動物胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌產(chǎn)生的一類特異性糖蛋白，是反芻動物獨有的糖蛋白[11]。Zoli等[12]利用放射免疫技術(shù)(RIA)測定妊娠母牛血液中PAG濃度變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAG濃度在妊娠20～240 d持續(xù)增長，產(chǎn)后PAG濃度逐漸降低。近年來，牛PAG研究主要集中在配種26 d以后，其原因在于胎盤糖蛋白在妊娠診斷中的應用只有在懷孕后26～30 d才能產(chǎn)生高敏感性和特異性[13]?？赡墁F(xiàn)有的檢測技術(shù)精確度仍有所欠缺，在低濃度條件下，敏感性、穩(wěn)定性、可重復性不夠，難以發(fā)現(xiàn)和總結(jié)母牛配后26 d前的PAG規(guī)律性變化。本試驗檢測配后0/1/8/17/21/18/35 d的PAG濃度，是為了研究配后0～35 d PAG濃度合理變化規(guī)律，雖然對照組與試驗組濃度有差異，但變化趨勢相似，即妊娠與未妊娠母牛PAG變化相似，與理論規(guī)律有所出入，這尚需進一步考證。

4.3 EPF作為牛妊娠診斷的依據(jù)

EPF優(yōu)勢在于無種屬差異[14]，制備檢測試劑盒的材料來源廣。有研究表明，奶牛受精24 h后，血清和乳中可檢測到EPF，妊娠終止，則會在48 h內(nèi)消失[15]。也就是說，體內(nèi)EPF的存在可以作為妊娠的標志物，也可以作為早期妊娠診斷的重要指標[16]，但目前圍繞EPF開展的早期妊娠診斷研究報道較少。本次試驗中，試驗組濃度高于對照組，且血液中差異更為明顯，在第8天就有明顯差異(P<0.05)，而尿液中需要到第28天才有明顯差異(P<0.05)，說明相同條件下，懷孕母牛的EPF濃度高于未孕的，且通過血液檢測EPF診斷是否妊娠，差異更顯著，效果更好。

4.4 牛早期妊娠診斷現(xiàn)狀及展望

反芻動物中，奶牛早期妊娠診斷的研究較多。常見的診斷方法有直腸檢查、超聲波B超檢查等臨床診斷和監(jiān)測激素變化的實驗室診斷[17]。臨床診斷方法對操作技術(shù)、檢測設備要求高，過程繁瑣，熟練的從業(yè)者最早只能在配后第35天確診牛的妊娠;此外，觸診可能會導致胚胎或胎兒意外死亡[18]。實驗室診斷則相對簡單和安全，最初采用放射免疫方法檢測早期妊娠母牛體內(nèi)激素變化，但昂貴的檢測設備和輻射危害，限制了實際生產(chǎn)中的使用和推廣。近年來，隨著酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)的快速發(fā)展，其更為簡潔、方便、快速的操作，在早期妊娠診斷領(lǐng)域里也有了更多的使用和研究。被診斷的動物從常見的奶牛，推廣到黃牛、羊、猴、大熊貓、黑熊等不同物種上。

檢測樣品呈現(xiàn)多元化，包括乳汁、血液、尿液、陰道粘液、糞等。其中，筆者認為，尿液是反映機體激素變化一種良好的媒介。優(yōu)勢在于，采集方便，不僅是在體內(nèi)激素變化的輔助診斷上具有重要價值[19]，而且適用于所有種屬動物，可以做到真正的無創(chuàng)[20]。對于肉牛來說，采集奶樣不方便，采血應激大，散養(yǎng)牛群綁定、固定操作難度大。以尿液作為妊娠診斷參考的研究也見于報道，蔡正華等[21]將妊娠母豬尿中雌酮水平作為妊娠診斷的依據(jù)，王宏娟等[10]用放免方法檢測孕牛尿液中生殖激素的變化規(guī)律，K.L. Evans等[22]用尿雌酮共軛分析法診斷馬的妊娠，J.Volkery等[23]試驗結(jié)論得出，妊娠羊駝尿中孕酮含量顯著高于非妊娠的，適合作為妊娠診斷的標準。

激素檢測方法上，主要分為放射免疫測定法(RIA)和酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)，后者簡單快速，更適合于實際生產(chǎn)。大部分早期妊娠診斷研究采用RIA，此方法對檢測設備的要求高，有輻射，使用范圍受限，不適合集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖場自行使用。自2010年后，ELISA試劑盒檢測激素變化的研究報道有所增加，A. Karen等[24]檢測孕牛血清PAG的濃度變化，以配種后第28天直腸檢測結(jié)果為標準，驗證了RIA法與ELISA法的檢測結(jié)果無差異，證明了ELISA檢測的可靠性和可行性。

綜上所述，肉牛的早期妊娠診斷研究少，且現(xiàn)有研究主要是通過血液中激素變化診斷鑒定，檢測手段主要是RIA。因此，本試驗探討的3個問題，對于肉牛的早期妊娠，第一，體內(nèi)的妊娠相關(guān)激素(P4、PAG、EPF)變化規(guī)律；第二，血液，尤其是尿液中的激素變化；第三，國產(chǎn)ELISA試劑盒檢測效果。為肉牛以尿液為檢測媒介的早期妊娠診斷研究提供了基礎工作依據(jù)。

5 結(jié) 論

肉牛母體內(nèi)P4、PAG、EPF濃度，血液中高于尿液中。通過ELISA檢測肉牛血液中EPF，能在配后第8天診斷母牛妊娠狀態(tài)。