， ，

(東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

桃葉衛(wèi)矛(EuonymusbungeanusMaxim)，又名絲棉木、白杜、明開夜合，是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬一種暖溫帶樹種，廣泛分布于我國境內，除廣東、廣西兩地未見野生種外，北起黑龍江，內蒙古等地，南至長江兩岸各省區(qū)均有野生資源存在，同時在世界上的其他一些國家也有分布，如烏蘇里地區(qū)、西伯利亞南部和朝鮮半島等地[1]。桃葉衛(wèi)矛樹皮灰色，幼時光滑，老時淺縱裂，樹冠圓形或卵圓形?；ㄆ?—6月，花色淡綠，聚傘花序。果期9—10月，蒴果粉紅色，可長期宿存于枝上。在冬季與白雪相互掩映，具有較高的觀賞價值[2]。桃葉衛(wèi)矛材質堅韌細致而潔白，可作雕刻用材，工藝制品等。劉繼陽等研究發(fā)現，桃葉衛(wèi)矛果實總皂苷對人肝癌細胞系-SMMC、人宮頸癌細胞系-HeLa和乳腺癌細胞系-MCF 7有明顯的抑制生長作用[3]。孫榮花等通過對桃葉衛(wèi)矛葉片提取物對CCL4致小鼠急性肝損傷的保護作用進行研究發(fā)現，桃葉衛(wèi)矛葉EtOAc和n-BuOH提取物具有良好的抗氧化效果和保肝作用，說明桃葉衛(wèi)矛葉作為茶飲用的同時具有保健作用[4]。由此表明，桃葉衛(wèi)矛具有極高的藥用價值，有待進一步的開發(fā)利用。

種子的休眠現象在植物種子中廣泛存在，了解并掌握種子的休眠機理，對于解除其休眠具有重要的指導意義[5-8]。由于桃葉衛(wèi)矛在生產實踐中廣泛采用播種育苗的方式[9]，若種子存在休眠現象，可能會導致出苗時間參差不齊，出苗率低。而現有的報道主要集中于桃葉衛(wèi)矛的種子催芽、栽培技術等方面。雖然對其種子催芽的方法已有探討，但對于其種子的休眠機理還沒有過系統(tǒng)的研究[10-12]。Baskin C C等[13]提出了一個全面的種子休眠分類系統(tǒng)，其中包括 5 個分類：生理休眠(PD)、形態(tài)休眠(MD)、形態(tài)生理休眠(MPD)、物理休眠(PY)、混合型休眠(PY+PD)。根據以上5種休眠的形成機制，采用室內試驗測試和統(tǒng)計分析方法，通過研究桃葉衛(wèi)矛種子種皮特性、胚形態(tài)發(fā)育及種子內源抑制物質，來探討桃葉衛(wèi)矛種子的休眠機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桃葉衛(wèi)矛種子來源于黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學校園內，選取 4株生長良好的桃葉衛(wèi)矛母樹采集種子。于2015年10月進行采種，測定種子千粒重為15.935 g，含水量6.0%。

1.2 研究方法

1.2.1 種子生活力與發(fā)芽能力測定

生活力測定：按《林木種子檢驗規(guī)程》[14]規(guī)定的TTC法進行測定。

發(fā)芽能力測定：種子發(fā)芽能力用發(fā)芽率表示。種子發(fā)芽試驗參照《國際種子檢驗規(guī)程》的方法[15]。

1.2.2 種皮透水性測定

取桃葉衛(wèi)矛種子6份，每份取1 g，其中3份用解剖針撬開外種皮，另3份為對照。每份種子稱質量后置25 mL試管中，加入一定量的蒸餾水，置恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃吸脹。每隔2 h取出種子，用濾紙吸干種子表面浮水，稱質量，然后放回試管中繼續(xù)吸水，直至種子吸水至恒定質量[16]。

1.2.3 種胚后熟過程中的形態(tài)發(fā)育

分別采用低溫沙藏和變溫沙藏的方法對種子進行處理，沙藏時間分別為7，14，21，28 d，然后進行取樣，每次10粒，以沙藏前的種子為對照，并解剖觀察種胚的形態(tài)和大小。具體操作為:沿種子的中軸線進行縱切，使胚和胚乳露出，在體視顯微鏡下觀察并測量種胚及胚乳的長度，計算胚率[17]。

1.2.4 種子內源抑制物質的生物測定

稱取2 g種子、胚乳和胚，分別置于錐形瓶中然后加入50 mL二氯甲烷溶液并混勻，然后密閉放入4 ℃冰箱中，每12 h震蕩1次，于36 h后過濾浸提液。將濾液用旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52)于40 ℃下蒸干，然后用蒸餾水定容至 50 mL[18]。最后，將浸提液分別稀釋至25%、50%、75%。

采用三葉草種子進行內源抑制物生物活性測定。每個培養(yǎng)皿中置50粒三葉草種子，分別取上述各體積分數的浸提液，每個培養(yǎng)皿注入5 mL。以同體積的蒸餾水作為對照。每處理3次重復，在恒溫光照培養(yǎng)箱內25 ℃進行培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計三葉草種子的發(fā)芽粒數(以露出子葉為發(fā)芽標準)，72 h后測定苗高和根長。

1.2.5 種子催芽(休眠解除)方法

針對桃葉衛(wèi)矛種子可能的休眠機制，采用赤霉素結合層積處理的方法和二因素完全隨機的方法，共設計了25種不同的催芽方法來探索適宜的催芽方法。

表1 因素水平

赤霉素處理: 將桃葉衛(wèi)矛種子進行消毒處理后，在室溫下用不同濃度赤霉素溶液浸種催芽48 h，赤霉素濃度分別為100，200，300，400 mg/L；層積溫度：1) 25 ℃層積：將經過5 g/kg KMnO4溶液消毒的種子與濕沙( 沙∶種=3∶1) 混勻后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中層積28 d；2) 4 ℃層積:將消毒后的種子與濕沙混勻后，在4 ℃下低溫層積28 d；3) 25 ℃/4 ℃層積:將消毒后的種子與濕沙混勻后，先在25 ℃下暖溫層積14 d，再轉移至4 ℃下低溫層積14 d；4) 4 ℃/25 ℃層積: 將消毒后的種子與濕沙混勻后，先在4 ℃下低溫層積14 d，再轉移至25 ℃下暖溫層積14 d。層積過程中每3 d適當補水，保持良好的水分和通氣狀態(tài)。

將上述處理后的桃葉衛(wèi)矛種子進行萌發(fā)試驗。具體方法參照1.2.1中發(fā)芽率測定。

1.3 數據分析

運用Excel及SPSS 20.0軟件進行數據統(tǒng)計分析、方差分析及差異性分析。

2 結果與分析

2.1 新采收桃葉衛(wèi)矛種子生活力與發(fā)芽力

種子生活力是指發(fā)芽的潛力或種胚所具有的生命力[19]。種子發(fā)芽力是指種子在適宜條件下能發(fā)芽并能長成植株的能力，是判斷種子播種品質最重要的指標，用發(fā)芽勢和發(fā)芽率來表示。而判斷該種子是否存在休眠，則可以通過比較種子生活力和種子發(fā)芽力，若種子生活力高于發(fā)芽力，說明該種子存在休眠。試驗結果表明，供試的桃葉衛(wèi)矛種子生活力為93%，而其發(fā)芽勢為0，發(fā)芽率為11%，種子生活力遠大于其發(fā)芽率，表明桃葉衛(wèi)矛種子可能存在顯著休眠，還需要進一步探究。

2.2 桃葉衛(wèi)矛種子透水性測定

由圖1可以看出，0～4 h內破皮種子的吸水速率和吸水率急劇上升，4～24 h內破皮種子的吸水速率逐漸降低，而吸水率趨于平穩(wěn)，24 h以后破皮種子的吸水率達到飽和，含水率為61.8%；而完整種子在0～12 h內吸水速率基本保持恒定，吸水率逐步升高，24 h后完整種子的吸水率達到61.1%，與破皮種子基本保持一致。

圖1 桃葉衛(wèi)矛種子吸水進程曲線

2.3 桃葉衛(wèi)矛種子催芽過程中胚形態(tài)發(fā)育

不同層積溫度及層積時間對桃葉衛(wèi)矛種子胚率的影響如圖2所示。由圖2可知，層積前桃葉衛(wèi)矛種子胚率為25.57%，當層積溫度為4 ℃、4 ℃/25 ℃時，通過28 d的觀察比較后可知，桃葉衛(wèi)矛種子胚率與層積前基本保持一致，差異不顯著；當層積溫度為25 ℃時，層積14 d后的種子胚率與層積前相比降低了3.17%，差異顯著，其余觀察時間的胚率與層積前差異不顯著；當層積溫度為25 ℃/4 ℃時，層積21 d后的種子胚率比層積前下降了3.73%，差異顯著，其余觀察時間胚率大小與層積前相比無明顯變化。

2.4 桃葉衛(wèi)矛種子內源抑制物活性測定

不同部位的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率和幼苗生長的影響如表2所示。當浸提液提取部位為胚時，不同濃度的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率沒有顯著的抑制作用(p>0.05)，由表2可以看出，經不同濃度浸提液處理后，三葉草幼苗的苗高與對照組差異不顯著，僅濃度為50%的胚浸提液處理后三葉草幼苗根長與對照組差異性顯著(p<0.05)；當浸提部位為胚乳時，不同濃度的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率的影響十分顯著(p<0.05)，由表2可以看出，隨著胚乳浸提液濃度的提高，三葉草種子發(fā)芽率較對照組分別降低了24%、38.34%、80.34%，同時胚乳浸提液對三葉草幼苗的苗高和根長均有顯著影響(p<0.05)，當胚乳浸提液濃度為50%時，三葉草幼苗苗高與其他濃度下的幼苗苗高差異性不顯著；當浸提部位為種子時，不同濃度的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率的影響十分顯著(p<0.05)，由表2可以看出，隨著種子浸提液濃度的提高，三葉草種子發(fā)芽率較對照組分別降低了31.34%、45%、55.34%，與之對應的三葉草幼苗苗高和根長較對照也出現了顯著差異。

圖2 不同層積溫度及層積時間對桃葉衛(wèi)矛種子胚率的影響

表2 不同部位的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率和幼苗生長的影響

注：數值代表實驗中每個處理3個重復的平均值±標準差，其后的小寫字母代表不同體積分數浸提液與對照組的差異顯著性(p<0.05)。

2.5 種子休眠解除方法

不同濃度赤霉素和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率影響的方差分析如表3所示。由表3可知，赤霉素和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率的影響均達到了極顯著水平(p<0.01)，同時二者的交互效應也達到了極顯著水平。從三者貢獻的離差平方和可以看出，赤霉素和層積溫度均為影響桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率的關鍵因素。由圖3可知，赤霉素處理和層積處理均會促進桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽，當赤霉素濃度為0 mg/L時，不同的層積溫度均對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率起到促進作用，且不同層積溫度之間差異不顯著；當赤霉素濃度達到100 mg/L或300 mg/L時， 25 ℃層積處理后的種子發(fā)芽率高于其他處理，且與對照組差異顯著；當赤霉素濃度為200 mg/L時，25 ℃層積處理和4 ℃/25 ℃層積處理后種子發(fā)芽率高于其他處理；當赤霉素濃度為400 mg/L時，未采用層積處理的種子出現嚴重霉變，其他層積處理之間差異不顯著。

表3 不同濃度赤霉素和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率影響的方差分析

注：雙因素方差分析置信區(qū)間為95%。

圖3 不同濃度赤霉素處理和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率的影響

3 討 論

種子休眠是影響種子萌發(fā)率的主要因素。本試驗中對新采收的桃葉衛(wèi)矛種子進行TTC染色法檢測后，測定其生活力為93%，而標準發(fā)芽試驗測定的發(fā)芽率僅為11%，由此可見，桃葉衛(wèi)矛種子存在一定程度的休眠。而引起種子休眠的原因有很多種，有的是屬于形態(tài)學上的特性，有的是屬于種子內部的代謝特性；有的可能由一種因素造成，也可能由多種因素共同影響。其中造成種子休眠的主要原因有：種皮障礙、胚休眠、內源抑制物的存在等[20]。因此本試驗通過對桃葉衛(wèi)矛種子種皮特性、胚形態(tài)發(fā)育及種子內源抑制物質的探究，進一步探討造成其種子休眠的具體原因。

一般而言，植物種皮對種子造成的萌發(fā)障礙包括以下3點：種皮透水性差、種皮透氣性差以及種皮的機械障礙[5]。趙潔等對唐古特瑞香的種子進行透水性檢驗后發(fā)現，唐古特瑞香種子吸水性良好[21]。對桃葉衛(wèi)矛種子的初步解剖和觀察結果表明，破皮種子的吸水速率雖然比完整種子的快，但是最終二者的吸水率是一致的，表明桃葉衛(wèi)矛種子種皮的透水性良好，不存在機械障礙導致其不能萌發(fā)。

以往的研究表明，種胚發(fā)育的適宜條件是在潮濕和一定溫度條件下，例如在濕土或濕沙中層積，經數周或數月種胚就能發(fā)育完全并獲得發(fā)芽能力。因此本試驗中，將桃葉衛(wèi)矛種子混入濕沙中置于不同溫度條件下進行層積。結果表明，不論采用何種層積方法桃葉衛(wèi)矛種子胚率在層積過程中都沒有出現顯著的變化，由此可以推斷桃葉衛(wèi)矛種子種胚已經發(fā)育成熟。

種子中存在發(fā)芽抑制物抑制種子發(fā)芽，并且這種抑制物質可以存在于種子的不同部位(種被、種胚或胚乳)中。因此，準確判斷抑制物質存在于種子的哪個部位可以有效地幫助種子快速催芽。本試驗對桃葉衛(wèi)矛種子不同部位進行浸提而獲得抑制物質，研究結果表明，桃葉衛(wèi)矛種子中的抑制物質主要存在于胚乳中，而胚的浸提液抑制作用不明顯。

綜上所述，桃葉衛(wèi)矛種子種皮透水性良好，種胚發(fā)育成熟，導致其休眠的主要原因是種子中(主要是在胚乳中)存在發(fā)芽抑制物質。因此，桃葉衛(wèi)矛屬于生理休眠(PD)[22]。同類型的休眠植物主要有：八棱海棠(Malusrobusta)[23]和山毛櫸(Fagussylvatica)[24]。而針對該類型的休眠，科研和生產上一般采用赤霉素結合層積的方法來進行休眠解除。本試驗結果表明，桃葉衛(wèi)矛的最適催芽方法為300 mg/L赤霉素處理48 h后，再將種子置于25 ℃環(huán)境條件下層積28 d，種子發(fā)芽率可在10 d內達到95%。

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