張昱，袁祖國，萬鵬

（寧波市鄞州人民醫(yī)院，浙江 寧波 315040）

絨毛膜癌是一種高度惡性的腫瘤，繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)或足月分娩后。少數(shù)可發(fā)生于異位妊娠后，多為育齡婦女，偶爾發(fā)生于未婚婦女的卵巢，稱為“原發(fā)性絨毛膜癌”。絨毛膜癌約有50%來自于滋養(yǎng)層細胞的葡萄胎，25%來自正常妊娠，25%來自異常妊娠或者墮胎[1-2]。因此，尋求妊娠絨毛膜癌的新型分子治療的靶點一直是研究的熱點。生存素（survivin）是細胞抗凋亡基因家族中的最小成員，也是唯一抗凋亡蛋白。它可通過影響Caspase-9活性或抑制Caspase-3的下游細胞凋亡共同通路抑制凋亡[3]；本研究探討survivin基因?qū)q癌JEG-3細胞增殖、遷移和凋亡的分子機制，從而為臨床上絨毛膜癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自Gibco公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin購自美國Invitrogen公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；氯仿、酒精（濃度為75%）及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR儀購自美國bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 絨毛膜癌細胞系JEG-3的培養(yǎng) 以人絨毛膜癌細胞系JEG-3為實驗材料 （購自中科院上海細胞研究院），經(jīng)離心收集后，以2×104/cm2的密度將其種植于25cm×25cm的培養(yǎng)瓶中。加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育，而后將細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 構(gòu)建survivin基因的慢病毒沉默表達載體shRNA-survivin載體 survivin基因慢病毒干擾shRNA-survivin載體由上海吉凱公司合成，選擇pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作為質(zhì)粒的克隆載體。過表達載體的克隆切入點是XhoI/BamHI，編號為ENST00000003569。經(jīng)過基因測序，從而證明序列的正確性。

1.2.3 絨毛膜癌細胞的分組與干預(yù)措施 按照不同的處理方法將絨毛膜癌細胞分成3組，即空白對照組、空白載體慢病毒對照組和shRNA-survivin載體慢病毒組。空白對照組為未做任何處理的細胞組，空白載體慢病毒對照組是經(jīng)空白載體的慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞組，shRNA-survivin載體慢病毒組是由shRNA-survivin載體構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染細胞組。以ZsGreen為慢病毒熒光探針，用熒光顯微鏡觀察細胞慢病毒的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 三組細胞融合率達80%后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化放入15mL離心管，加入 1mL 的 Trizol RNA iso （Takara，日本），提取總RNA，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書檢測總RNA的純度，1.9～2.0為純度良好。逆轉(zhuǎn)錄cDNA保存在4℃冰箱中備用。根據(jù)Takara熒光定量PCR試劑盒的說明書要求，采用20μL的反應(yīng)體系，加入各樣品進行熒光定量PCR檢測。采用FS2000系統(tǒng)對PCR進行分析，反應(yīng)條件預(yù)設(shè)為預(yù)變性：95℃ 30 秒；1 個循環(huán)。 PCR：95℃ 5 秒；60℃30秒，40個循環(huán)。溶解曲線：95℃ 5秒；60℃ 1分鐘。降溫：50℃30秒，1個循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH、survivin、Caspase-3和Caspase-9引物由上海生工公司生產(chǎn)。采用2-△△CT的方法計算目的基因的相對表達量。詳見表1。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Transwell小室實驗檢測細胞的遷移 三組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按說明書要求將基底膜的基質(zhì)原液放在冰箱冷藏（4℃）過夜融化，然后與預(yù)冷無血清的DMEM培養(yǎng)基按照1:3的比例配置侵襲上室凝膠液體，以每孔55μL的量包被Transwell小室的上室，放置于37℃的孵育箱，2小時后使上室成膠。再上室每孔接種200μL不含血清的細胞培養(yǎng)液，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500μL，并將Transwell板放置在37℃的孵育箱中培養(yǎng)24小時后用結(jié)晶紫染色。最后將Transwell板用倒置光學(xué)顯微鏡拍照，并進行細胞計數(shù)。

1.2.6 CCK-8實驗檢測細胞的增殖 三組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，接種在96孔板中，以每孔5000個/100μL的接種量接種，按照CCK-8試劑盒說明書72小時后每孔加入10μL的CCK-8的試劑，放入37℃的孵育箱中培養(yǎng)2小時。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.7 AV-PI試劑盒檢測細胞的凋亡 三組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照AV-PI試劑盒說明書檢測細胞的凋亡率。流式細胞儀分析各組樣本，計算各組凋亡率。Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡和壞死細胞，Annexin V-/PI+為正常細胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用（±s）表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 shRNA-survivin載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 以綠色熒光蛋白（GFP）為熒光探針，完成survivin沉默表達的慢病毒載體的構(gòu)建。慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，以人絨毛膜癌細胞系JEG-3為實驗對象，慢病毒轉(zhuǎn)染率如圖1所示。shRNA-survivin載體慢病毒轉(zhuǎn)染滴度為 3×108TU/mL。

2.2 survivin、Caspase-3及 Caspase-9 mRNA 的表達 與空白對照組和空白載體慢病毒組比較，shRNA-survivin載體慢病毒組的survivin mRNA的相對表達量顯著降低，而Caspase-3的mRNA、Caspase-9的mRNA顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。 詳見表 2。

2.3 Transwell實驗檢測細胞的遷移 各組透過分子篩的細胞數(shù)分別為：空白對照組131.32±18.39，空白載體慢病毒對照組142.11±14.02，shRNA-survivin載體慢病毒組52.11±4.09。三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.982，P＜0.05），其中 shRNA-survivin載體慢病毒組與空白對照組、空白載體慢病毒對照組比較，透過分子篩的細胞數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），如圖3所示。

圖1 0.011μL慢病毒轉(zhuǎn)染 JEG-3系效率要高于0.033μL慢病毒，表現(xiàn)為熒光亮度較強。

圖2 三組survivin、Caspase-3及Caspase-9的表達

圖3 三組透過分子篩的細胞數(shù)

圖4 CCK-8檢測細胞的增殖

2.4 CCK-8檢測細胞的增殖 各組細胞的增殖率分別為：空白對照組（60.34±1.24）%、空白載體慢病毒對照組 （51.12±2.47）%、shRNA-survivin 載體慢病毒組（24.27±3.11）%。三組細胞的增殖率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.983，P＜0.05），其中，shRNASurvivin載體慢病毒組與空白對照組、空白載體慢病毒對照組比較細胞增殖率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），如圖 4所示。

圖5 三組的細胞凋亡率

2.5 AV-PI檢測細胞凋亡的AV-PI結(jié)果 細胞凋亡率三組分別為：空白對照組（4.21±1.24）%，空白載體慢病毒對照組 （3.09±1.13）%，shRNA-survivin載體慢病毒組（35.21±13.31）%，三組凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=30.009，P＜0.05）， 其中 shRNA-survivin載體慢病毒組與空白對照組、與空白載體慢病毒對照組比較細胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），如圖5所示。

3 討論

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族（Apoptosis inhibitor protein，AIP）成員中分子量最小的一個，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強凋亡抑制因子[4-5]。survivin基因在大多數(shù)的腫瘤組織中呈特異性表達，比如甲狀腺癌[6-7]、膀胱癌[8]、胃癌[9-10]、大腸癌[11-12]、宮頸癌[13]和食道癌[14]。survivin基因的高表達與腫瘤的復(fù)發(fā)、淋巴浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，survivin基因與絨癌發(fā)生發(fā)展密切[16]。本研究中，作者通過RNAi的方法構(gòu)建shRNA-survivin載體慢病毒轉(zhuǎn)染人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞并探究各組中survivin基因的表達，探討survivin基因的作用，以尋找治療絨癌細胞的新靶點。

表2 三組survivin、Caspase-3及Caspase-9 mRNA的表達

Caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們的重要共同點是活性位點都含有半胱氨酸，并特異地斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵[17]。本研究通過RT-qPCR方法檢測survivin在人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的表達。shRNA-survivin載體慢病毒組比空白載體病毒組相比，Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平明顯升高 （P＜0.05），可見 shRNA-survivin載體對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的凋亡作用非常明顯。

另外，本研究采用Transwell的實驗方法檢測腫瘤細胞的遷移，結(jié)果提示，三組透過分子篩的細胞數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中shRNA-survivin載體慢病毒組分別與空白對照組、空白載體慢病毒對照組比較均顯著降低 （P＜0.05）。故shRNA-survivin在人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的遷移中具有明顯的抑制作用。

本研究還利用CCK-8實驗檢測腫瘤細胞的增殖。三組增殖率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中shRNA-survivin載體慢病毒組分別與空白對照組、與空白載體慢病毒對照組比較顯著降低 （P＜0.05），提示shRNA-survivin通過抑制survivin基因的表達，進而對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的增殖具有明顯的抑制作用。

最后，本研究利用AV-PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞的凋亡，三組凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中 shRNA-survivin 載體慢病毒組分別與空白對照組、與空白載體慢病毒對照組比較凋亡率明顯升高（P＜0.05），提示 shRNA-survivin 通過抑制survivin基因的表達，進而對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞的過度凋亡具有明顯的促進作用。

綜上，shRNA-survivin通過抑制survivin基因的表達，從而對絨癌JEG-3細胞的增殖、遷移有抑制作用，對人絨毛膜癌細胞系JEG-3細胞凋亡具有促進作用。