袁 瑞，楊 寧，姜 秦，王正麗

( 青島農業(yè)大學，海洋科學與工程學院，山東 青島 266109 )

魚粉是水產(chǎn)飼料的優(yōu)質蛋白源，然而，近年來過度捕撈和不良氣候使魚粉產(chǎn)量降低，魚粉價格逐年增長[1]。尋找優(yōu)質廉價的替代蛋白源成為水產(chǎn)飼料研究的主要問題之一。大豆蛋白消化吸收率高、價格低、資源豐富，可作為替代蛋白源成為研究熱點[2]。

但是，大豆蛋白中所含有的抗營養(yǎng)因子限制了其利用[3]。其中大豆異黃酮屬于黃酮類化合物，是大豆中較為常見的抗營養(yǎng)因子，在飼料中超過一定劑量對動物的生長、健康及對飼料中營養(yǎng)物質的利用率均有負面作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中豆粕對魚粉的替代水平超過75%時，影響羅非魚(Oreochromissp.)的生長、消化酶和轉氨酶活性，而這與豆粕中所含的抗營養(yǎng)因子大豆異黃酮的含量相關[4]；在飼料中添加1～3 g/kg大豆異黃酮對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)生長無顯著影響，但添加量達到4 g/kg時，顯著抑制褐牙鲆生長[5]。也有研究表明，飼料中適量的大豆異黃酮對動物生長有一定促進作用[6-8]。Zhou等[6]發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中大豆異黃酮含量的增加，卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)的生長性能顯著提高，40 mg/kg為最適添加量，添加量達60～80 mg/kg時則表現(xiàn)出抑制作用。而對陸生動物中的研究則表明，除了影響生長，大豆異黃酮無論在體內或體外還具有免疫調節(jié)作用[9-10]，能夠提高小鼠的殺傷細胞反應[11]、調節(jié)人類的細胞免疫[12]等。但目前有關大豆異黃酮對魚類影響的研究多集中在豆粉替代魚粉后對魚類生長產(chǎn)生的影響上，研究結果也存在較大的差異。大豆異黃酮是否具有增強魚類免疫的作用及其相關機理仍不明確。因此，為進一步研究大豆異黃酮對魚類的免疫效應，筆者建立了離體細胞模型，研究了離體條件下大豆異黃酮對褐牙鲆相關免疫細胞的免疫效應。

褐牙鲆是我國北方沿海地區(qū)廣泛養(yǎng)殖的重要海水魚類之一[13]。頭腎巨噬細胞[14]和外周血白細胞[15]是褐牙鲆重要的免疫細胞，在褐牙鲆免疫過程中起重要作用。本試驗旨在研究大豆異黃酮對體外培養(yǎng)的褐牙鲆頭腎巨噬細胞和外周血白細胞免疫力的影響，明確大豆異黃酮對褐牙鲆的免疫細胞是否具有免疫促進抑或抑制作用，為大豆異黃酮在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中的添加以及植物蛋白源的合理開發(fā)和利用提供試驗依據(jù)。為尋求新的水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料原料替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用褐牙鲆購自日照某養(yǎng)殖場，體質量(250±12) g，健康無傷，暫養(yǎng)于海水循環(huán)系統(tǒng)中。水溫17～19 ℃，鹽度32～40，溶氧8.0 mg/L以上，每日投喂商品飼料兩次。

1.2 細胞的分離培養(yǎng)

1.2.1 褐牙鲆頭腎巨噬細胞的分離培養(yǎng)

在超凈臺內剖取褐牙鲆頭腎，研磨備用。采用Ortuńo的方法分離褐牙鲆頭腎巨噬細胞[16]，將頭腎研磨液過100目篩絹，加入到34%/51% percoll(Solarbio公司)分離液的液面，4 ℃，2200 r/min離心25 min，吸取中間層巨噬細胞；然后加入3 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液，1200 r/min離心5 min后洗滌兩次，加入2% FBS-L-15(添加1%雙抗、4%抗凝劑、2%胎牛血清)重懸得巨噬細胞。

1.2.2 外周白細胞的分離

在無菌條件下，用含有抗凝劑的注射器尾靜脈抽血，分離外周血白細胞[17]。取稀釋血液加入到60% Percoll分離液液面上，4 ℃，2200 r/min離心25 min后，從上到下依次為血漿層、白細胞層、粒細胞層、紅細胞層，于白細胞層輕輕吸取白細胞；加入3 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液，1200 r/min離心5 min后洗滌兩次，用2% FBS-L-15重懸得白細胞。

1.2.3 細胞計數(shù)及培養(yǎng)

用臺盼藍法檢測分離頭腎細胞和白細胞活性[16]，用2% FBS-L-15培養(yǎng)基調整這兩種細胞的密度為107個/mL，分別接種到96孔板中，每孔100 μL細胞液，放置于19 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，棄上清液以去除未貼壁細胞，然后分別加入100 μL含有0、0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL大豆異黃酮的細胞培養(yǎng)液(添加不同質量濃度大豆異黃酮的2% FBS-L-15培養(yǎng)基)，放于19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個梯度設置4個重復。

1.3 免疫指標測定

1.3.1 氧呼吸爆發(fā)活力測定

采用Dolmatova[18]的方法稍作修改。吸棄細胞培養(yǎng)液上清，每孔中加入100 μL氯化硝基四氮唑藍溶液[質量濃度為1 mg/mL，含有10 μL 1 mg/mL的乙酸肉豆蔻佛波醇]，在19 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育40 min后吸棄上清液，加入200 μL 100%甲醇固定10 min，用200 μL 70%甲醇洗滌細胞兩次后每孔加入120 μL KOH(2 mol/L)和140 μL二甲基亞砜(100%)，用酶標儀在620 nm測定吸光值。

1.3.2 增殖活力測定

采用MTT法[19]稍作修改。不同細胞中加入10 μL噻唑藍(5 mg/mL MTT)，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(100%)，用酶標儀在490 nm測定吸光值。

1.3.3 吞噬活力的測定[19-20]

1.3.3.1 頭腎巨噬細胞吞噬活力

在每孔細胞中加入20 μL密度為5×108cfu/mL的自制鰻弧菌懸液，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h；吸棄上清液后再每孔加100 μL 0.2%的吐溫-20，反應10 min后加10 μL噻唑藍(MTT 5 mg/mL)，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；吸棄上清液后，每孔再加150 μL二甲基亞砜(100%)10 min后，用酶標儀在490 nm下測定吸光值。

1.3.3.2 外周血白細胞吞噬活力

將培養(yǎng)后的外周血白細胞96孔板1000 r/min離心，吸棄上清液。每孔加入0.075%的中性紅溶液100 μL，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h；離心棄上清液，用200 μL 0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液洗凈未被吞噬的中性紅；每孔加150 μL細胞裂解液(乙酸∶無水乙醇=1∶1)，19 ℃恒溫培養(yǎng)過夜反應后，用酶標儀測定510 nm下的吸光值。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，當P<0.05時認為差異顯著，進行Duncan多重比較。

2 結 果

在體外培養(yǎng)條件下，大豆異黃酮對褐牙鲆頭腎巨噬細胞和外周血白細胞免疫力有顯著影響(P<0.05)，且隨著培養(yǎng)液中大豆異黃酮質量濃度的增加，細胞免疫力呈先增加后降低的趨勢。

2.1 不同質量濃度大豆異黃酮在體外對褐牙鲆頭腎巨噬細胞免疫力的影響

2.1.1 對褐牙鲆頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

體外培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)中不同質量濃度大豆異黃酮顯著影響褐牙鲆頭腎巨噬細胞的氧呼吸爆發(fā)活力(P<0.05)(圖1)。當大豆異黃酮質量濃度為0.5 mg/mL時，褐牙鲆巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活力顯著高于對照組和其他處理組(P<0.05)，而最高質量濃度組(2 mg/mL)的氧呼吸爆發(fā)活力顯著低于最低質量濃度組(0.1 mg/mL)(P<0.05)，其他處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同質量濃度大豆異黃酮在體外對褐牙鲆頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

2.1.2 對褐牙鲆頭腎巨噬細胞增殖活力的影響

細胞培養(yǎng)液中大豆異黃酮質量濃度為0.1、0.5、1.0 mg/mL時，褐牙鲆頭腎巨噬細胞增殖活力顯著增加(P<0.05)，在質量濃度為0.5 mg/mL時活力最高；隨著大豆異黃酮質量濃度的增加，褐牙鲆頭腎巨噬細胞增殖活力顯著降低，當大豆異黃酮質量濃度為2 mg/mL時，頭腎巨噬細胞增殖活力最低，顯著低于對照組和其他處理組(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同質量濃度大豆異黃酮在體外對褐牙鲆頭腎巨噬細胞增殖活力的影響

2.1.3 對褐牙鲆頭腎巨噬細胞吞噬活力的影響

當細胞培養(yǎng)液中大豆異黃酮質量濃度為0.5 mg/mL和1.0 mg/mL時，褐牙鲆頭腎巨噬細胞吞噬活力顯著高于對照組和其他處理組(P<0.05)，質量濃度在0.5 mg/mL時值最高；而當細胞培養(yǎng)液中大豆異黃酮質量濃度為2.0 mg/mL時，褐牙鲆巨噬細胞的吞噬活力值最低(P<0.05)(圖3)。

2.2 不同質量濃度大豆異黃酮在體外對褐牙鲆外周血白細胞免疫力的影響

2.2.1 對褐牙鲆外周血白細胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

不同質量濃度大豆異黃酮顯著影響褐牙鲆外周血白細胞氧呼吸爆發(fā)活力(P<0.05)，當培養(yǎng)液中大豆異黃酮質量濃度為0.5、1.0 mg/mL時，白細胞氧呼吸爆發(fā)活力顯著高于對照組(P<0.05)；0.1、1.5 mg/mL處理組則與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖3 不同質量濃度大豆異黃酮在體外對褐牙鲆頭腎巨噬細胞吞噬活力的影響

圖4 不同質量濃度大豆異黃酮下褐牙鲆外周血白細胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

2.2.2 對褐牙鲆外周血白細胞增殖活力的影響

培養(yǎng)液中添加不同質量濃度大豆異黃酮顯著增強了褐牙鲆外周血白細胞的增殖活力(P<0.05)，且大豆異黃酮質量濃度為0.5 mg/mL時，白細胞增殖活力值最高(圖5)。

2.2.3 對褐牙鲆外周血白細胞吞噬活力的影響

不同質量濃度大豆異黃酮顯著影響了褐牙鲆外周血白細胞的吞噬活力(P<0.05)(圖6)，大豆異黃酮質量濃度為0.5 mg/mL時褐牙鲆外周血白細胞吞噬活力最高，顯著高于其他試驗組(P<0.05)；隨著培養(yǎng)液中大豆異黃酮質量濃度的增加，褐牙鲆外周血白細胞吞噬活力顯著降低，當大豆異黃酮質量濃度為2.0 mg/mL時，白細胞吞噬活力最低，顯著低于其他試驗組(P<0.05)。

圖5 不同質量濃度大豆異黃酮下褐牙鲆外周血白細胞的增殖活力

圖6 不同質量濃度大豆異黃酮下褐牙鲆外周血白細胞的體外吞噬活力

3 討 論

大豆異黃酮是大豆中主要的植物雌激素，是一種具有類雌激素性質的抗營養(yǎng)因子[7]。研究表明，動物飼糧中添加適量的大豆異黃酮能夠促進動物生長，降低飼料成本，增強機體免疫力[21]。日糧中添加大豆異黃酮能夠促進蛋雞免疫器官發(fā)育，提高免疫功能[22]；大豆異黃酮顯著影響了仔豬生長、免疫性能等[8]。但是，大豆異黃酮在水產(chǎn)動物中的研究較少，Tzchori等[23]在飼料中添加2、20 μg/g的大豆異黃酮促進了歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)的生長；張偉[7]研究發(fā)現(xiàn)，當飼料中大豆異黃酮含量在4800 μg/g以下時，對異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的生長無顯著影響，而當含量超過7200 μg/g時，則顯著抑制異育銀鯽的生長。在本試驗中，離體條件下大豆異黃酮顯著影響褐牙鲆頭腎巨噬細胞和外周血白細胞的免疫力。培養(yǎng)液中大豆異黃酮的質量濃度為0.5 mg/mL時，顯著促進了褐牙鲆相關免疫活力；但大豆異黃酮質量濃度進一步增加，褐牙鲆的免疫力反而下降，在本試驗條件下，當大豆異黃酮質量濃度為2.0 mg/mL時，褐牙鲆的細胞呼吸爆發(fā)活力、巨噬細胞增殖活力和吞噬活力降低，培養(yǎng)液中高質量濃度的大豆異黃酮對褐牙鲆的細胞免疫力表現(xiàn)出抑制作用。

頭腎巨噬細胞和外周血白細胞均屬于魚類主要的吞噬細胞，其對免疫的影響主要體現(xiàn)在呼吸爆發(fā)活力、增殖活力和吞噬活力。顆粒與吞噬細胞的結合或其它可溶性物質的刺激可以激發(fā)吞噬細胞產(chǎn)生大量的活性氧[超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)等]。這些活性氧殺滅細菌和微生物的過程即為呼吸爆發(fā)[24]。在本試驗中，大豆異黃酮在體外增強了頭腎巨噬細胞和外周血白細胞氧呼吸爆發(fā)活力，增強效果隨質量濃度的增加先升后降。Disilvestro等[25]曾報道大豆異黃酮可以提高人體紅細胞內超氧化物歧化酶的活性；Zhou等[6]研究也表明，添加大豆異黃酮改善了機體抗氧化狀態(tài)，抑制自由基的形成，從而減少脂質超氧化物的形成。因此大豆異黃酮對細胞呼吸爆發(fā)活力的影響可能主要體現(xiàn)在對細胞內氧自由基的產(chǎn)生上。但大豆異黃酮對呼吸爆發(fā)活力的影響有一個閾值，當添加量超過一定值則產(chǎn)生抑制作用。吞噬細胞為魚體內主要的免疫細胞，外來微生物入侵后即開始增殖以殺死外來入侵微生物[26]；吞噬作用是細胞內消化、殺滅和消化入侵的微生物過程，這包括了顆粒與細胞表面接觸、消化形成吞噬體以及分解吞噬體中的顆粒三個步驟[27]。本試驗結果表明，大豆異黃酮顯著影響頭腎巨噬細胞和外周血白細胞的增殖活力及吞噬活力。Tang等[28]發(fā)現(xiàn)，異黃酮衍生物可以通過抑制巨噬細胞和骨髓基質細胞中相關蛋白的信號通路，抑制破骨細胞的形成，可以推論大豆異黃酮可以通過介導與細胞增殖和吞噬作用相關的蛋白表達來影響其活力，或者是通過影響細胞內信號通路的完成來影響巨噬細胞和白細胞的增殖活力。

本試驗在離體條件下，在培養(yǎng)液中添加大豆異黃酮培養(yǎng)巨噬細胞和白細胞，顯示添加不同質量濃度的大豆異黃酮對褐牙鲆頭腎巨噬細胞和外周血白細胞的免疫效果具有顯著影響，推測存在一個促進魚類生長的適宜大豆異黃酮質量濃度，為進一步在飼料中添加大豆異黃酮，促進動物免疫的研究提供了參考。但飼料中大豆異黃酮的影響受機體更為復雜的調控機制作用，也與魚的種類、規(guī)格、性別、食性、生理狀態(tài)、養(yǎng)殖系統(tǒng)等多種因素影響，其作用效果和機理有待于進一步探討。

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