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        曲美他嗪對(duì)急性心肌缺血再灌注損傷大鼠的治療效果及對(duì)Bcl_2、Caspase_3蛋白表達(dá)的影響

        2018-03-10 06:48:37朱雪梅
        心腦血管病防治 2018年1期
        關(guān)鍵詞:低劑量心肌細(xì)胞灰度

        朱雪梅

        心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜,已有的研究認(rèn)為與自由基損傷、鈣離子超載、心肌纖維代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、中性粒細(xì)胞和細(xì)胞凋亡等諸多因素有關(guān)[1]。分子心血管病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),細(xì)胞凋亡參與心肌缺血再灌注損傷過(guò)程,是心肌細(xì)胞損傷的主要形式,其發(fā)生、發(fā)展受多種基因的調(diào)控[2]。本研究探討曲美他嗪對(duì)急性心肌缺血再灌注損傷大鼠的治療效果及對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病_2基因(Bcl_2)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶_3(Caspase_3)表達(dá)的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取健康成年雄性SD大鼠48只,體重250~300g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,許可證號(hào)SCXK(京)2016_0008。將大鼠隨機(jī)分為四組:假手術(shù)組、模型組、曲美他嗪低劑量組(低劑量組)和曲美他嗪高劑量組(高劑量組),每組12只。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法:

        1.2.1 缺血再灌注損傷模型制備:腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg麻醉,麻醉成功后固定大鼠四肢、頭部。將針型電極插入四肢皮下,記錄心電圖。氣管插管后連接呼吸機(jī)正壓通氣。沿胸骨左緣第3、4肋間開(kāi)胸,逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織、肌肉,剪開(kāi)心包,暴露心臟。假手術(shù)組大鼠在冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線、不結(jié)扎;對(duì)模型組、低劑量組和高劑量組大鼠制備急性心肌缺血再灌注損傷模型,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳連線中點(diǎn)下方約2mm處將縫合針穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支深部,在肺動(dòng)脈圓錐旁出針,將一根直徑1.5mm的凹槽硅膠管置于結(jié)扎線與血管之間,拉緊結(jié)扎線,使硅膠管壓迫冠狀動(dòng)脈左前降支而致閉塞。保持缺血狀態(tài)30min后松開(kāi),再灌注2h。在缺血30min時(shí)低劑量組給予10mg/kg曲美他嗪灌胃,高劑量組給予20mg/kg曲美他嗪灌胃。假手術(shù)組和模型組均給予等體積生理鹽水灌胃。以心電圖ST段抬高≥0.3mV和(或)T波高聳、局部心肌出現(xiàn)紫紺作為心肌缺血標(biāo)志;心電圖ST段降低和(或)T波恢復(fù)、心肌缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅為再灌注成功標(biāo)志。

        1.2.2 免疫組化檢測(cè):取心尖部心肌組織采用生理鹽水沖洗,4%多聚甲醛固定24h,石蠟包埋,制成5μm切片。經(jīng)二甲苯、100%乙醇、75%乙醇梯度脫水后用蒸餾水洗。蘇木素染色,自來(lái)水沖洗,鹽酸乙醇分化。自來(lái)水浸泡后置入伊紅液。經(jīng)95%乙醇、100%乙醇、二甲苯脫水后中性樹(shù)膠封固,顯微鏡下觀察。

        1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè):采用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡,切片常規(guī)脫蠟,滴加30ml/L的H202,室溫處理10min。切片加5μl/ml的蛋白酶K、37℃消化15min。加標(biāo)記緩沖液,按每張切片取末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶和DIG_d_UTP,加入標(biāo)記緩沖液中,混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液。37℃標(biāo)記2h。室溫加封閉液30min。滴加生物素化抗地高辛抗體,37℃反應(yīng)30min。滴加試劑SABC,37℃反應(yīng)60min。DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)酯封片。顯微鏡下觀察。陽(yáng)性對(duì)照采用試劑公司附帶切片;陰性對(duì)照以PBS代替標(biāo)記液,其余步驟相同。

        1.2.4 HE染色觀察:采用HE染色法分別進(jìn)行Bcl_2、Caspase_3蛋白染色,將切片放置于預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸處理的載玻片上,70℃烤片2h。脫蠟前再次烤片15min。切片常規(guī)脫蠟,熱修復(fù)抗原:高壓鍋加熱至270℃沸騰后,將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中,噴氣后調(diào)至140℃ 2min。滴加3%的H2O2,室溫反應(yīng)15min,滅活內(nèi)源性酶。滴加50g/L牛血清白蛋白封閉液,室溫反應(yīng)15min。分別滴加一抗、結(jié)合抗原,4℃過(guò)夜。室溫靜置2h,滴加生物素化山羊抗兔IgG,室溫孵育30min。滴加SABC,20℃ 30min。DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察,以試劑盒中自帶陽(yáng)性對(duì)照片為陽(yáng)性對(duì)照;陰性對(duì)照采用PBS代替一抗,其余步驟相同。

        1.2.5 心肌酶檢測(cè):造模成功后,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2ml,4℃、3000r/min離心15min,取上層血清凍存于-80℃冰箱保存待測(cè)。統(tǒng)一采用日立7060型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定心肌酶CK、LDH含量。

        2 結(jié)果

        2.1 各組心肌HE染色觀察:假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊,胞核清晰可見(jiàn),胞漿著色均勻;模型組大鼠心肌細(xì)胞核濃縮,細(xì)胞空泡變性,心肌纖維排列紊亂,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);低劑量組大鼠心肌纖維排列仍較紊亂,細(xì)胞間質(zhì)輕中度水腫,可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);高劑量組大鼠心肌纖維排列正常,細(xì)胞間質(zhì)輕度水腫,圖1見(jiàn)封3。

        2.2 各組心肌酶CK、LDH比較:模型組、低劑量組和高劑量組CK和LDH明顯高于假手術(shù)組(P<0.05),見(jiàn)表1。

        表1 各組心肌酶CK、LDH、AI值比較

        注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與低劑量組比較#P<0.05

        2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡情況:假手術(shù)組心肌可偶見(jiàn)細(xì)胞凋亡;模型組心肌細(xì)胞凋亡明顯增多,呈彌漫分布;低劑量組心肌凋亡有所減少,而高劑量組心肌凋亡明顯減少,圖2見(jiàn)封3。模型組、低劑量組和高劑量組AI值明顯高于假手術(shù)組(P<0.05),見(jiàn)表1。

        2.4 各組Bcl_2、Caspase_3蛋白表達(dá)情況:模型組、低劑量組和高劑量組Caspase_2蛋白表達(dá)灰度值明顯高于假手術(shù)組,而B(niǎo)cl_2蛋白表達(dá)灰度值明顯低于假手術(shù)組(P<0.05),見(jiàn)表2,圖3見(jiàn)封3。

        表2 各組Bcl_2、Caspase_3蛋白表達(dá)灰度值比較

        注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與低劑量組比較#P<0.05

        3 討論

        缺血性心臟病是嚴(yán)重危害中老年人身體健康和生命安全的心血管疾病,隨著我國(guó)社會(huì)人口老齡化進(jìn)程,急性心肌梗死已成為缺血性心臟病患者死亡的首要原因,對(duì)急性心肌梗死的主要治療目標(biāo)是促進(jìn)冠狀動(dòng)脈再通、恢復(fù)局部血供[3]。但近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn),缺血心肌再灌注后可能導(dǎo)致心律失常、心肌頓抑、無(wú)復(fù)流、甚至猝死等一系列再灌注損傷[4]。如何預(yù)防和治療缺血再灌注損傷是目前臨床研究的熱點(diǎn)。

        SD大鼠在進(jìn)化學(xué)關(guān)系上與人類(lèi)接近,兩者的遺傳基因相似率高達(dá)90%。大鼠的冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少,發(fā)生缺血性損傷后早期即可出現(xiàn)心肌壞死、心律失常,并具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性[5]。左冠狀動(dòng)脈前降支是大鼠左心供血的主要血管,因此本研究通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制心肌缺血再灌注損傷模型。本研究中與假手術(shù)組相比,模型組、低劑量組和高劑量組大鼠心肌組織均發(fā)生不同程度梗死,提示缺血再灌注模型制備成功。

        目前對(duì)于缺血心肌再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中具有重要作用,心肌細(xì)胞凋亡可影響心肌梗死面積、加速心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)等,而再灌注損傷也會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡,尤其是梗死灶的收縮帶區(qū)域,導(dǎo)致細(xì)胞縮小、胞質(zhì)凝縮、核膜崩解、胞漿空泡變等病理改變[6]。有研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)的缺血和缺血后再灌注的心肌均可引起細(xì)胞凋亡,盡管再灌注可阻止心肌壞死,但卻不能阻止已壞死的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。曲美他嗪是一種抗心絞痛類(lèi)藥物,通過(guò)保護(hù)細(xì)胞在缺血缺氧狀態(tài)下的能量代謝、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)揮療效[8]。本文假手術(shù)組心肌組織未見(jiàn)明顯改變,模型組心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞嚴(yán)重水腫,低劑量組和高劑量組心肌細(xì)胞腫脹減輕,這一結(jié)果提示,持續(xù)的缺血和缺血后再灌注可引起心肌細(xì)胞水腫、凋亡,而曲美他嗪可有效逆轉(zhuǎn)心肌損傷和細(xì)胞凋亡。

        心肌細(xì)胞內(nèi)的LDH、CK、CK_MB、AST是廣泛存在于細(xì)胞漿中的酶類(lèi),其中CK、LDH是心肌胞漿中的特異性酶[9]。當(dāng)缺血再灌注損傷引起細(xì)胞膜、線粒體損傷、細(xì)胞膜通透性增加時(shí),心肌細(xì)胞內(nèi)的各種酶類(lèi)釋放入血,因此血清酶學(xué)指標(biāo)水平可間接反映心肌細(xì)胞的損傷程度[10]。其中CK、LDH可作為評(píng)估心肌損傷程度、心肌梗死范圍的定量指標(biāo)[11]。本研究中高劑量組CK、LDH和AI值均明顯低于低劑量組和模型組,這一結(jié)果提示,曲美他嗪可有效減輕心肌損傷程度、縮小梗死范圍,其對(duì)心肌的保護(hù)作用與劑量有關(guān),高劑量下心肌保護(hù)作用更強(qiáng)。

        Bcl_2、Caspase_3是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白[12]。Bcl_2基因也稱(chēng)為抗凋亡蛋白,是目前公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因[13]。心肌缺血再灌注損傷時(shí),心肌細(xì)胞Bcl_2基因表達(dá)下調(diào),使蛋白線粒體膜的通透性發(fā)生改變,細(xì)胞色素C釋放入胞漿中,激活Caspase_3而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[14]。Caspase_3的底物是多聚ADP核糖聚合酶,具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[15]。本研究中模型組、低劑量組和高劑量組

        Caspase_2蛋白表達(dá)灰度值明顯高于假手術(shù)組,而B(niǎo)cl_2蛋白表達(dá)灰度值明顯低于假手術(shù)組;高劑量組Caspase_2蛋白表達(dá)灰度值明顯低于低劑量組和模型組,而B(niǎo)cl_2蛋白表達(dá)灰度值明顯高于低劑量組和模型組。這一結(jié)果提示,曲美他嗪對(duì)急性心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用是通過(guò)上調(diào)Bcl_2蛋白表達(dá),下調(diào)Caspase_2蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

        綜上所述,高劑量曲美他嗪能抑制急性心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡,與其上調(diào)Bcl_2蛋白表達(dá),下調(diào)Caspase_2蛋白表達(dá)有關(guān)。

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