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        聯(lián)合監(jiān)測血清AFP-L3與HBV DNA在診斷肝硬化癌變中的價(jià)值

        2018-03-08 08:07:34王瑜王志軍
        關(guān)鍵詞:癌變乙型肝炎一致性

        王瑜,王志軍

        (1.河南科技大學(xué)附屬安陽市第五人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,河南 安陽 455001;2.河南省安陽市人民醫(yī)院 普外科,河南 安陽 455000)

        乙 型 肝 炎 病 毒(hepatitis B virus,HBV) 的復(fù)制與乙型肝炎肝硬化癌變關(guān)系密切;甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是一種糖蛋白,依據(jù)對小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin,LCA)親和電泳的反應(yīng)性,AFP可以被分為3種異質(zhì)體:L1、L2及L3,AFP-L3與小扁豆凝集素高親和力,僅由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。為了解乙型肝炎肝硬化癌變患者HBV復(fù)制狀況以及AFP-L3的表達(dá)情況及其診斷價(jià)值,本研究對66例乙型肝炎肝硬化癌變和71例乙型肝炎肝硬化患者的血清HBV DNA及AFP-L3進(jìn)行了聯(lián)合檢測,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料

        選取2013年10月-2015年8月在安陽市第五人民醫(yī)院就診資料完整的門診及住院患者,其中66例乙型肝炎肝硬化癌變(肝硬化癌變組)和71例乙型肝炎肝硬化(肝硬化組)。肝硬化癌變組均經(jīng)臨床、影像及病理學(xué)確診,原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國衛(wèi)生部頒發(fā)的2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[1],其中,男39例,女27例;年齡33~76歲(中位數(shù)55歲);均有乙型肝炎肝硬化病史8~26年(中位數(shù)19年)。肝硬化組中,男53例,女18例;年齡20~76歲(中位數(shù)49歲);病程6~21年(中位數(shù)13年);診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年全國傳染病與寄生蟲病學(xué)術(shù)會議診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,兩組之間在性別、年齡、乙型肝炎肝硬化病史等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

        1.2 試劑及儀器

        AFP-L3和總AFP檢測采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法,所用Maglumi 2000 plus全自動化學(xué)發(fā)光測定儀及配套試劑購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物工程股份有限公司,AFP-L3親和吸附離心管購自北京熱景生物技術(shù)有限公司。HBV DNA定量測定采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)進(jìn)行檢測,檢測試劑盒由廈門安普利生物工程有限公司提供,使用美國AMI公司生物PE2400擴(kuò)增儀。

        1.3 操作方法

        1.3.1 HBV DNA定量測定 ①提取核酸:血清標(biāo)本50μl加入等量提取液并震蕩混勻,吸取前吹打以便吸取固體沉淀顆粒物;瞬時(shí)離心后,100℃金屬浴10 min,12 000 r/min離心10 min,留取上清液。②qRT-PCR檢測:配制PCR反應(yīng)液(35.6μl HBV反應(yīng)混合液+0.4μl Taq 酶),每管分別加入2μl待測樣本、陽性對照和陰性對照,混勻后瞬時(shí)離心,置入qRT-PCR儀中,以95℃ 3 min、94℃ 15 s、60℃ 30 s進(jìn)行40個循環(huán)的擴(kuò)增,收集FAM、HEX通道熒光信號,記錄檢測結(jié)果。HBV DNA>5.00+2Ecopies/ml為陽性。

        1.3.2 AFP-L3分離 首先取患者血清400μl加入600μl清洗液中混勻。親和吸附離心管的上部離心管置入離心外管,以3 000 r/min離心20 s去除保護(hù)液,吸取稀釋后的血清600μl加入上部離心管中,室溫下放置10 min;加入清洗液1.2 ml,也以3 000 r/min離心20 s,丟棄上清液。而后加入600μl洗脫液,同樣3 000 r/min離心20 s,收集離心柱外管中的液體,即為含AFP-L3的樣本;用電化學(xué)發(fā)光法檢測總的AFP和AFP-L3的含量,計(jì)算AFP-L3占AFP總量的百分比。以2005年美國FDA設(shè)定的AFP-L3/AFP>10%作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,AFP-L3及HBV DNA陽性率采用χ2檢驗(yàn)。AFP-L3及HBV DNA的一致性檢驗(yàn)采用Kappa評價(jià),判斷標(biāo)準(zhǔn)為Kappa值≤0.40,說明一致性較差;0.40<Kappa值<0.75,說明一致性一般;Kappa值≥0.75,說明有較好的一致性。敏感性=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陽性人數(shù))×100%;特異性=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組AFP-L3及HBV DNA陽性率比較

        兩組血清AFP-L3陽性率分別為74.2%(49/66)和9.9%(7/71),兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=58.667,P=0.000),肝硬化癌變組高于肝硬化組;兩組血清HBV DNA陽性率分別為59.1%(39/66)和33.8%(24/71),兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.806,P=0.003),肝硬化癌變組高于肝硬化組。

        2.2 兩組血清AFP-L3及HBV DNA結(jié)果的一致性比較

        兩組AFP-L3與HBV DNA結(jié)果總符合率為87.6%(120/137);兩組結(jié)果的一致性檢驗(yàn)采用Kappa評價(jià),Kappa=0.748,說明2種方法吻合程度一般。見表1。

        表1 血清AFP-L3及HBV DNA的一致性比較 例

        2.3 血清AFP-L3及HBV DNA聯(lián)合檢測對肝硬化癌變診斷的效能比較

        AFP-L3與HBV DNA并聯(lián)診斷肝硬化癌變的敏感性與單獨(dú)檢測AFP-L3比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.371,P=0.012),并聯(lián)診斷高于單獨(dú)檢測;兩者串聯(lián)診斷肝硬化癌變的特異性與單獨(dú)AFP-L3檢測比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.132,P=0.716)。見表2。

        表2 血清AFP-L3及HBV DNA單獨(dú)/聯(lián)合檢測對肝硬化癌變診斷的效能比較 %

        3 討論

        AFP是一種腫瘤相關(guān)的糖蛋白,依據(jù)對LCA親和電泳的反應(yīng)性,AFP可以被分為3種異質(zhì)體:L1、L2及L3,AFP-L1不與LCA反應(yīng)存在于慢性肝炎和肝硬化中,構(gòu)成非惡性肝病中總AFP的主要部分;AFP-L2與LCA有中度親和力,主要來源于卵黃囊腫瘤,在懷孕期間在母體的血清中也可以檢測到[2];AFP-L3與LCA高親和力結(jié)合,它是一種異常糖基化的AFP,僅由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生,近年來被FDA批準(zhǔn)用于原發(fā)性肝癌的臨床輔助診斷,第四屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議也將AFP-L3定為原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)記物之一。

        本研究表明,肝硬化癌變組AFP-L3的陽性率高于肝硬化組,兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。JIA等[3]的研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者AFP-L3陽性率為75.5%(77/102)與本組結(jié)果基本相符。多項(xiàng)研究表明[4-6],即使AFP水平較低的患者,AFP-L3也有較高的表達(dá),AFP-L3對于AFP陰性的早期肝癌也是良好的標(biāo)記物。AFP-L3具有較高的特異性,可用于肝癌患者術(shù)后的隨訪。AFP-L3如果術(shù)后不能轉(zhuǎn)陰,往往提示預(yù)后不良[7-8]。

        HBV感染是HCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一,HBV DNA高復(fù)制狀態(tài)常被認(rèn)為是發(fā)生HCC的高危因素。多因素分析表明,乙型肝炎肝硬化患者HBV DNA陽性是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素[9]。一項(xiàng)長達(dá)14年的關(guān)于乙型肝炎病毒載量與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)[10],HBV DNA是啟動肝癌重要的預(yù)警因子,癌變患者HBV DNA陽性率達(dá)80.5%(70/87)。也有研究表明[11]HBV DNA的載量越高發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)性越高。本組中癌變患者HBV DNA陽性率也高于肝硬化患者。

        AFP-L3及HBV DNA檢驗(yàn)結(jié)果具有一定程度的一致性(Kappa值=0.748,雖沒有達(dá)到0.75,但也十分接近),說明兩者有一定的關(guān)聯(lián),均可以作為乙型肝炎肝硬化癌變的重要標(biāo)志物。本研究表明,AFP-L3及HBV DNA并聯(lián)檢測的敏感性高于單獨(dú)檢測AFP-L3及HBV DNA,2指標(biāo)并聯(lián)檢測敏感性的升高,能有效地避免部分AFP-L3陰性或HBV DNA陰性患者的漏診,用于原發(fā)性肝癌的早期篩查具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。與單獨(dú)檢測AFP-L3相比,兩者的串聯(lián)檢測的特異性沒有明顯提高,說明單獨(dú)檢測AFP-L3對于乙型肝炎肝硬化癌變患者診斷有較高的準(zhǔn)確率。

        AFP-L3及HBV DNA檢驗(yàn)結(jié)果具有一定程度的一致性,均可以作為乙型肝炎肝硬化癌變的重要標(biāo)志物。AFP-L3及HBV DNA并聯(lián)檢測能夠提高診斷乙型肝炎肝硬化癌變敏感性,可以有效地減少癌變患者的漏診。

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