王瑜，王志軍

（1.河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市第五人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 安陽(yáng) 455001；2.河南省安陽(yáng)市人民醫(yī)院 普外科，河南 安陽(yáng) 455000）

乙 型 肝 炎 病 毒（hepatitis B virus，HBV） 的復(fù)制與乙型肝炎肝硬化癌變關(guān)系密切；甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是一種糖蛋白，依據(jù)對(duì)小扁豆凝集素（lens culinaris agglutinin，LCA）親和電泳的反應(yīng)性，AFP可以被分為3種異質(zhì)體：L1、L2及L3，AFP-L3與小扁豆凝集素高親和力，僅由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。為了解乙型肝炎肝硬化癌變患者HBV復(fù)制狀況以及AFP-L3的表達(dá)情況及其診斷價(jià)值，本研究對(duì)66例乙型肝炎肝硬化癌變和71例乙型肝炎肝硬化患者的血清HBV DNA及AFP-L3進(jìn)行了聯(lián)合檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年10月-2015年8月在安陽(yáng)市第五人民醫(yī)院就診資料完整的門診及住院患者，其中66例乙型肝炎肝硬化癌變（肝硬化癌變組）和71例乙型肝炎肝硬化（肝硬化組）。肝硬化癌變組均經(jīng)臨床、影像及病理學(xué)確診，原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)的2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[1]，其中，男39例，女27例；年齡33～76歲（中位數(shù)55歲）；均有乙型肝炎肝硬化病史8～26年（中位數(shù)19年）。肝硬化組中，男53例，女18例；年齡20～76歲（中位數(shù)49歲）；病程6～21年（中位數(shù)13年）；診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年全國(guó)傳染病與寄生蟲病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩組之間在性別、年齡、乙型肝炎肝硬化病史等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑及儀器

AFP-L3和總AFP檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，所用Maglumi 2000 plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀及配套試劑購(gòu)自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物工程股份有限公司，AFP-L3親和吸附離心管購(gòu)自北京熱景生物技術(shù)有限公司。HBV DNA定量測(cè)定采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒由廈門安普利生物工程有限公司提供，使用美國(guó)AMI公司生物PE2400擴(kuò)增儀。

1.3 操作方法

1.3.1 HBV DNA定量測(cè)定 ①提取核酸：血清標(biāo)本50μl加入等量提取液并震蕩混勻，吸取前吹打以便吸取固體沉淀顆粒物；瞬時(shí)離心后，100℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心10 min，留取上清液。②qRT-PCR檢測(cè)：配制PCR反應(yīng)液（35.6μl HBV反應(yīng)混合液+0.4μl Taq 酶），每管分別加入2μl待測(cè)樣本、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，混勻后瞬時(shí)離心，置入qRT-PCR儀中，以95℃ 3 min、94℃ 15 s、60℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，收集FAM、HEX通道熒光信號(hào)，記錄檢測(cè)結(jié)果。HBV DNA＞5.00+2Ecopies/ml為陽(yáng)性。

1.3.2 AFP-L3分離 首先取患者血清400μl加入600μl清洗液中混勻。親和吸附離心管的上部離心管置入離心外管，以3 000 r/min離心20 s去除保護(hù)液，吸取稀釋后的血清600μl加入上部離心管中，室溫下放置10 min；加入清洗液1.2 ml，也以3 000 r/min離心20 s，丟棄上清液。而后加入600μl洗脫液，同樣3 000 r/min離心20 s，收集離心柱外管中的液體，即為含AFP-L3的樣本；用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)總的AFP和AFP-L3的含量，計(jì)算AFP-L3占AFP總量的百分比。以2005年美國(guó)FDA設(shè)定的AFP-L3/AFP＞10%作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，AFP-L3及HBV DNA陽(yáng)性率采用χ2檢驗(yàn)。AFP-L3及HBV DNA的一致性檢驗(yàn)采用Kappa評(píng)價(jià)，判斷標(biāo)準(zhǔn)為Kappa值≤0.40，說(shuō)明一致性較差；0.40＜Kappa值＜0.75，說(shuō)明一致性一般；Kappa值≥0.75，說(shuō)明有較好的一致性。敏感性=真陽(yáng)性人數(shù)/（真陽(yáng)性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù)）×100%；特異性=真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%。

2 結(jié)果

2.1 兩組AFP-L3及HBV DNA陽(yáng)性率比較

兩組血清AFP-L3陽(yáng)性率分別為74.2%（49/66）和9.9%（7/71），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=58.667，P=0.000），肝硬化癌變組高于肝硬化組；兩組血清HBV DNA陽(yáng)性率分別為59.1%（39/66）和33.8%（24/71），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.806，P=0.003），肝硬化癌變組高于肝硬化組。

2.2 兩組血清AFP-L3及HBV DNA結(jié)果的一致性比較

兩組AFP-L3與HBV DNA結(jié)果總符合率為87.6%（120/137）；兩組結(jié)果的一致性檢驗(yàn)采用Kappa評(píng)價(jià)，Kappa=0.748，說(shuō)明2種方法吻合程度一般。見(jiàn)表1。

表1 血清AFP-L3及HBV DNA的一致性比較 例

2.3 血清AFP-L3及HBV DNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝硬化癌變?cè)\斷的效能比較

AFP-L3與HBV DNA并聯(lián)診斷肝硬化癌變的敏感性與單獨(dú)檢測(cè)AFP-L3比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.371，P=0.012），并聯(lián)診斷高于單獨(dú)檢測(cè)；兩者串聯(lián)診斷肝硬化癌變的特異性與單獨(dú)AFP-L3檢測(cè)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.132，P=0.716）。見(jiàn)表2。

表2 血清AFP-L3及HBV DNA單獨(dú)/聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝硬化癌變?cè)\斷的效能比較 %

3 討論

AFP是一種腫瘤相關(guān)的糖蛋白，依據(jù)對(duì)LCA親和電泳的反應(yīng)性，AFP可以被分為3種異質(zhì)體：L1、L2及L3，AFP-L1不與LCA反應(yīng)存在于慢性肝炎和肝硬化中，構(gòu)成非惡性肝病中總AFP的主要部分；AFP-L2與LCA有中度親和力，主要來(lái)源于卵黃囊腫瘤，在懷孕期間在母體的血清中也可以檢測(cè)到[2]；AFP-L3與LCA高親和力結(jié)合，它是一種異常糖基化的AFP，僅由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，近年來(lái)被FDA批準(zhǔn)用于原發(fā)性肝癌的臨床輔助診斷，第四屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議也將AFP-L3定為原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)記物之一。

本研究表明，肝硬化癌變組AFP-L3的陽(yáng)性率高于肝硬化組，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。JIA等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者AFP-L3陽(yáng)性率為75.5%（77/102）與本組結(jié)果基本相符。多項(xiàng)研究表明[4-6]，即使AFP水平較低的患者，AFP-L3也有較高的表達(dá)，AFP-L3對(duì)于AFP陰性的早期肝癌也是良好的標(biāo)記物。AFP-L3具有較高的特異性，可用于肝癌患者術(shù)后的隨訪。AFP-L3如果術(shù)后不能轉(zhuǎn)陰，往往提示預(yù)后不良[7-8]。

HBV感染是HCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，HBV DNA高復(fù)制狀態(tài)常被認(rèn)為是發(fā)生HCC的高危因素。多因素分析表明，乙型肝炎肝硬化患者HBV DNA陽(yáng)性是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素[9]。一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)14年的關(guān)于乙型肝炎病毒載量與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)[10]，HBV DNA是啟動(dòng)肝癌重要的預(yù)警因子，癌變患者HBV DNA陽(yáng)性率達(dá)80.5%（70/87）。也有研究表明[11]HBV DNA的載量越高發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)性越高。本組中癌變患者HBV DNA陽(yáng)性率也高于肝硬化患者。

AFP-L3及HBV DNA檢驗(yàn)結(jié)果具有一定程度的一致性（Kappa值=0.748，雖沒(méi)有達(dá)到0.75，但也十分接近），說(shuō)明兩者有一定的關(guān)聯(lián)，均可以作為乙型肝炎肝硬化癌變的重要標(biāo)志物。本研究表明，AFP-L3及HBV DNA并聯(lián)檢測(cè)的敏感性高于單獨(dú)檢測(cè)AFP-L3及HBV DNA，2指標(biāo)并聯(lián)檢測(cè)敏感性的升高，能有效地避免部分AFP-L3陰性或HBV DNA陰性患者的漏診，用于原發(fā)性肝癌的早期篩查具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。與單獨(dú)檢測(cè)AFP-L3相比，兩者的串聯(lián)檢測(cè)的特異性沒(méi)有明顯提高，說(shuō)明單獨(dú)檢測(cè)AFP-L3對(duì)于乙型肝炎肝硬化癌變患者診斷有較高的準(zhǔn)確率。

AFP-L3及HBV DNA檢驗(yàn)結(jié)果具有一定程度的一致性，均可以作為乙型肝炎肝硬化癌變的重要標(biāo)志物。AFP-L3及HBV DNA并聯(lián)檢測(cè)能夠提高診斷乙型肝炎肝硬化癌變敏感性，可以有效地減少癌變患者的漏診。

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