朱波，曾琪，潘廣瑞，趙暉

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，云南 昆明 650032）

抗菌肽LL-37是人體內固有免疫成員。近來研究表明，其在抗感染、免疫調節(jié)、促血管生成、抑癌及促癌等方面均發(fā)揮生物學作用[1]。且作為泌尿道重要的天然免疫因子，在從腎盂到膀胱黏膜的上皮中均有表達，并在細菌侵入時迅速合成和分泌，提示其與泌尿系感染密切相關[2]。MICHAUD等[3]發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥可促進膀胱癌的發(fā)生。同時也有研究顯示膀胱癌會被急性炎癥抑制[4]。SUTTMANN等[5]還報道合成抗菌肽天蠶素A、B可抑制膀胱癌的增殖，對良性的纖維母細胞則幾乎沒有影響。這些發(fā)現(xiàn)引導筆者聯(lián)想到LL-37和膀胱癌間的聯(lián)系，該實驗旨在初步探討兩者的關系，為今后研究奠定基礎，以期望為膀胱癌的治療找到一條新的途徑。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

T24、EJ和SV-HUC-1細胞株均購于中國科學院昆明動物研究所細胞庫，LL-37ELISA試劑盒購自荷蘭Hycult公司，LL-37由上海吉爾生化有限公司合成，PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，β-actin多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，兔抗人LL-37多克隆抗體由美國Abcam公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 膀胱癌T24、EJ細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，SV-HUC-1細胞則僅將基礎培養(yǎng)基更換為DMEM高糖，均置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，每2、3天更換培養(yǎng)液，當細胞匯合度達80%～90%時傳代。

1.2.2 ELISA法檢測尿液、細胞培養(yǎng)液上清中LL-37的水平 2014年1月-2014年6月昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院膀胱癌患者30例，并隨機選取30例健康志愿者，收集他們的新鮮晨尿后照LL-37檢測試劑盒說明書對樣本進行檢測。將3株細胞以1×105個/ml的密度接種于24孔板，300μl/孔，待細胞匯合度達60%時更換無血清培養(yǎng)液，分別加入1、5和10μg/ ml LPS，各設3個副孔及空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)后照LL-37檢測試劑盒說明書對各孔進行測定。

1.2.3 免疫組織化學和RT-PCR檢測膀胱癌組織及其周圍組織LL-37的表達 2014年1月-2014年9月昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院膀胱癌患者30例，術中取癌組織標本及其周圍1 cm以內的黏膜、肌層組織標本（外觀上無明顯炎癥反應），作為腫瘤組、癌旁組。依據(jù)免疫組織化學試劑盒說明書操作，反應后呈棕黃色判定為LL-37陽性。參考文獻[6]設計并合成LL-37引物，正向引物：5'-GATA ACAAGAGATTTGCCCTGCTG-3'，反向引物：5'-TTTC TCAGAGCCCAGAAGCCTG-3'，擴增片段大小為173 bp，內參照β-actin正向引物：5'-CCCATCTATG AGGGTTACGC-3'，反向引物：5'-TTTAATGTCACGC ACGATTC-3'，擴增片段大小為150 bp，均由上海華大基因公司合成。采用Trizol法提取組織總RNA。PCR反 應 體 系：模 板 DNA 1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs 4μl、LL-37正 反 向 引 物 各 0.5μl、ddH2O 15μl、TaqDNA 聚 合酶 0.25μl。PCR 反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。反應后對PCR反應液行瓊脂糖凝膠電泳以確認RTPCR擴增產物（約173 bp）。若該位置有條帶，則用瓊脂糖凝膠回收并行克隆和測序。最后照PCR試劑盒說明書行RT-PCR反應，結束后確認RT-PCR的擴增和融解曲線及PCR定量時制作的標準曲線。

1.2.4 MTT檢測細胞經LL-37處理的增殖情況將3株細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板，100μl/孔。分別加入22.5、45.0、90.0、180.0和270.0μg/ml LL-37，各設5個副孔及空白對照組。24 h后加入20μl/孔 MTT（5mg/ml），孵育4 h后吸棄孔內培養(yǎng)液，加入150μl/孔 DMSO混勻10 min。酶標儀上測490 nm處吸光度OD值，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）來表示，兩獨立樣本比較用t檢驗，各組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 尿液、組織標本及細胞培養(yǎng)液上清中LL-37的表達

2.1.1 膀胱癌患者尿液中LL-37水平 膀胱癌組和健康對照組的LL-37水平分別為（24.32±0.02）和（2.02±0.06）ng/ml，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=1 931.240，P=0.000），膀胱癌患者尿液中LL-37水平較健康對照組升高。

2.1.2 各組織中LL-37的表達 LL-37在膀胱癌組織中表達陰性，而在癌組織周圍的炎癥細胞、血管壁及平滑肌內卻呈陽性表達。見圖1。

2.1.3 各組織中LL-37的表達 以β-actin的PCR產物條帶亮度作為陽性對照，亮度越高提示LL-37表達越高，可見膀胱癌旁組織中LL-37的表達比癌組織相對較高。見圖2。

經過RT-PCR得出膀胱癌組織和膀胱癌旁組織中LL-37基因表達的Ct值Ct癌、Ct癌旁，分別與內參β-actin的Ct值Ct內參比較，經過公式2ΔCt=2Ct癌/癌旁-Ct內參計算后可見膀胱癌旁組織中LL-37的表達約是癌組織的30倍。見圖3。

2.1.4 細胞培養(yǎng)液上清中LL-37的表達 SVHUC-1、T24、EJ細胞經LPS刺激后細胞培養(yǎng)液上清中LL-37濃度均升高，提示隨著LPS濃度增加，3株細胞中LL-37表達升高。見表1。

2.2 體外LL-37作用后細胞的增殖情況

如表2所示，各濃度LL-37的T24、EJ、SVHUC-1細胞的吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對T24、EJ細胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈一定劑量依賴性，而LL-37在濃度達270μg/ml時才表現(xiàn)出對SV-HUC-1細胞的抑制作用。

圖1 各組織中LL-37的表達 （免疫組織化學法×100）

圖2 各組織中LL-37的表達

圖3 癌及癌旁組織LL-37的相對表達

表1 細胞培養(yǎng)上清液中LL-37的表達（n=4，ng/ml，±s）

表1 細胞培養(yǎng)上清液中LL-37的表達（n=4，ng/ml，±s）

注：? 與 0μg/ml組比較，P＜0.05

組別 SV-HUC-1 T24 EJ 0μg/ml 8.09±0.12 5.32±1.84 7.53±0.12 1μg/ml 9.41±0.67 20.78±2.84? 7.99±0.55 5μg/ml 41.41±3.28? 50.15±4.07? 10.27±0.59?10μg/ml 54.00±2.89? 62.51±0.54? 13.33±0.34?F值 435.308 389.821 144.225 P值 0.000 0.000 0.000

表2 MTT檢測細胞的吸光度值比較 （n=6，±s）

表2 MTT檢測細胞的吸光度值比較 （n=6，±s）

注：? 與 0.0μg/ml組比較，P＜0.05

T24 EJ SV-HUC-1 0.0μg/ml 0.703±0.0461 0.922±0.0592 0.342±0.0056 22.5μg/ml 0.579±0.0469? 0.773±0.1096? 0.339±0.0096 45.0μg/ml 0.555±0.0229? 0.708±0.0939? 0.336±0.0077 90.0μg/ml 0.541±0.0331? 0.576±0.0485? 0.329±0.0104 180.0μg/ml 0.505±0.0236? 0.413±0.0311? 0.330±0.0061 270.0μg/ml 0.384±0.0239? 0.226±0.0664? 0.289±0.0074?F值 54.720 83.360 35.830 P值 0.000 0.000 0.000組別

3 討論

近年來研究顯示，LL-37與腫瘤的關系很微妙，其可抑制胃癌、結腸癌細胞的增值，又能促進乳腺癌、卵巢癌、肺癌的生長[7]，更值得一提的是LL-37可在同一腫瘤中表現(xiàn)為抗癌和促癌作用。VON等[8]發(fā)現(xiàn)，20～30 ng/ml LL-37可促進肺癌細胞的增值，而將其濃度調為20μg/ml后癌細胞的數(shù)量明顯減少。LI等[9]發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞分泌的Cathelicidin類抗菌肽可促進結腸癌細胞生長；與REN等[10]的研究結論不同之處也在于其所用的LL-37濃度為生理水平甚至更低，用于人、鼠結腸癌細胞的各為1μg/ml、100 ng/ml，而文獻中LL-37的濃度為20～60μmol/l。由此可見LL-37濃度的差異對腫瘤的影響。

該實驗中LL-37在膀胱癌患者尿液中的濃度較健康志愿者高，那么這一升高的LL-37來源于何處呢？結合免疫組織化學法結果來看，LL-37主要表達在癌組織周圍的平滑肌、炎癥細胞及血管壁等處，而在癌組織中表達陰性，提示這一升高的LL-37很可能來自于這些癌旁組織或者說是腫瘤細胞生長微環(huán)境中的炎癥細胞等分泌。且最近有研究表明，胰腺導管腺癌微環(huán)境中的LL-37在胰腺腫瘤干細胞介導的腫瘤發(fā)生中起著關鍵性的作用[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，髓細胞表達的鼠同源Cathelicidin抗菌肽CLAMP可通過募集炎癥細胞促進肺癌的生長，且腫瘤細胞會分泌可溶性因子誘導巨噬細胞中LL-37的表達，提示LL-37、炎癥和腫瘤有著密切的聯(lián)系[12]。朱小丹等[13]在體外將巨噬細胞和卵巢癌細胞共同培養(yǎng)以構建簡化的腫瘤微環(huán)境模型時，也發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可通過增強抗菌肽LL-37的表達和分泌促進卵巢癌細胞的增殖。這些研究提示，腫瘤微環(huán)境中LL-37的存在及其對腫瘤的影響。該研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織的微環(huán)境中有明顯的LL-37表達，且經LPS刺激后膀胱癌細胞培養(yǎng)液上清中也有其濃度的升高，提示這些濃度范圍內的LL-37對膀胱尿路上皮癌是沒有害處的。然而，當在體外使用22.5～270μg/ml LL-37時，其可抑制膀胱癌細胞的增殖，而對正常尿路上皮細胞的抑制作用則不明顯，表明在一定的濃度范圍內LL-37對腫瘤細胞的殺傷作用更大。同時研究表明，多西他賽搭載LL-37后的溫敏凝膠顆?？商岣邔Υ竽c癌腹膜轉移癌的抗癌效果，提示治療腫瘤時可聯(lián)合使用LL-37[14]。對于該研究中提示的體內外LL-37的不同作用，筆者認為和前述的LL-37在同一腫瘤中表現(xiàn)為抗癌和促癌一樣，是由濃度的差異所引起的。

另外，有學者在探討LL-37對卵巢癌的作用時，采用基因芯片技術對LL-37在膀胱癌的表達也進行檢測，結果顯示，1例膀胱癌組織中有明顯的LL-37表達，這可能是由于其在采集腫瘤組織標本中的同時也包含了膀胱平滑肌、血管等組織，且只有1例，而與該實驗結果有出入[15]。而最新研究結果顯示，膀胱癌細胞可通過分泌LL-37來抑制BCG的內化，在加入LL-37抗體后，BCG的抗腫瘤效應又明顯增強，提示一定濃度的LL-37可能更適應膀胱腫瘤的生長，這在某些方面上與該研究結論有著相似之處[16]。然而，該研究中關于LL-37和膀胱尿路上皮癌的探討還僅限于初級階段，尚需后期進一步實驗來闡釋兩者間復雜的關系。

該研究通過LPS刺激可誘發(fā)T24、EJ和SVHUC-1細胞分泌LL-37，表明除了正常尿路上皮細胞，膀胱尿路上皮癌細胞同樣可以產生LL-37。同時，筆者還發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤細胞微環(huán)境中存在著一定濃度的LL-37，提示其可能在腫瘤的發(fā)病中起到一定作用，然而是腫瘤細胞促進LL-37的產生，還是LL-37誘導腫瘤的發(fā)生，尚需進一步證實。且該研究中僅檢測30例膀胱癌患者的腫瘤組織標本，樣本數(shù)不是很大，但其還是在一定程度上提示LL-37與膀胱尿路上皮癌的相關性。另外，體外高濃度的LL-37可抑制膀胱癌T24、EJ細胞的增殖。

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