劉 杰，李英英，孫 哲，劉維康，劉守川，趙坤坤

（洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南 洛陽 471000）

2017年5月洛陽某豬場保育豬出現(xiàn)咳嗽，喘氣、關(guān)節(jié)腫大等癥狀。對3頭發(fā)病豬進(jìn)行剖檢，取病變組織進(jìn)行病原學(xué)鑒定，結(jié)果檢測出豬藍(lán)耳病毒、副豬嗜血桿菌。結(jié)合臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗室診斷，確診為豬藍(lán)耳病繼發(fā)副豬嗜血桿菌。

1 材料與方法

1.1 臨床情況及取樣

某豬場保育豬出現(xiàn)咳嗽，喘氣，關(guān)節(jié)腫大等癥狀，發(fā)病率30%，死亡率20%。選取3頭有發(fā)熱、咳嗽并伴跛行等癥狀的病豬進(jìn)行剖檢。剖檢可見心包積液增多、呈淡黃色，肺臟邊緣有黃色纖維素性滲出物，肺臟尖葉和心葉出現(xiàn)實(shí)變，關(guān)節(jié)積液增多，顏色微黃（圖1）。根據(jù)臨床癥狀及病理情況分別采集扁桃體、肺臟等組織進(jìn)行病原檢測和細(xì)菌分離。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），由青島海博試劑有限公司提供；革蘭氏染色試劑， 購自北京索萊寶科技有 限 公 司；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等購自寶生物（大連）工程有限公司；細(xì)菌微量生化管及藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購自臺灣旭基。

1.3 方法

1.3.1 病毒樣品處理

取肺臟和扁桃體健康部位與病變部位的交界處0．5 g置于滅菌平皿內(nèi)，用眼科剪剪碎，置于玻璃研磨器中，并加入約1 mL滅菌PBS進(jìn)行研磨。將已研磨好的組織樣品勻漿液轉(zhuǎn)入15 mL滅菌離心管中用滅菌的PBS定容至5 mL，取1mL至1．5 mL滅菌離心管中，液氮及室溫反復(fù)凍融3次。

1．3．1．1 病毒 RNA 提取

取組織研磨液，8 000 r/min離心2 min，取上清液作為待檢樣品。分別取待檢樣品、陽性對照和陰性對照各200μL，按照病毒核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行核酸的提取。

1．3．1．2 cDNA 的制備

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序為25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，20 ℃ 1 min，之后保存。

RT-PCR采 用20μL反 應(yīng) 體系， 即 2×ES Reaction Mix 10μL，EasyscriptRT/RI Enzyme mix 1μL，隨機(jī)引物1μL，RNA模板8μL。

圖1 剖檢圖片

1.3.2 細(xì)菌分離

無菌采取病死豬肺臟，分別接于含TSA+血清培養(yǎng)基、血平板和TSA+血清+NAD培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和常規(guī)細(xì)菌生化試驗。

1.3.3 分子鑒定

根據(jù)豬藍(lán)耳病毒序列，參照GenBank PRRSV的全基因序列中的ORF7末端序列設(shè)計了一對特異性的引物，序列為：5’-GAA TGG CCA GCC AGT CAA TC-3’， PRRSV-436R ：5’-GTC GCC CTA ATT GAA TAG GTG AC-3’，擴(kuò)增出目的片段大小為436 bp，該引物由英濰捷基（北京）貿(mào)易有限公司合成。

PCR采用25μL反應(yīng)體系，即10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，PRRSV-436F/ PRRSV-436R 引 物 各 1．0μL，DNA 模 板 2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR反 應(yīng) 條 件 為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，20 ℃ 1 min后保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA基因，張盼峰等[1]設(shè)計了一對特異性引物，引物序列為：P1：5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3’，P2：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GT-3’，擴(kuò)增出的目的片段大小為821 bp，該引物由英濰捷基（北京）貿(mào)易有限公司合成。

PCR采 用25μL反 應(yīng) 體系， 即 10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，P1/P2引 物 各 1．0μL，DNA 模 板2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR 反應(yīng)條件為 ：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共 30 個循環(huán) ；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1．5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.4 ERIC-PCR指紋圖譜分析

參照M RAFIEE等[2]報道提供的引物進(jìn)行分析，引物序列為：ERI C-1R：5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’，ERIC-2：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’。

PCR采 用25μL反 應(yīng) 體系， 即 10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，上 下 游 引 物 各 1．0μL，DNA 模 板2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR 反應(yīng) 條 件 為：95 ℃ 2 min，94℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃6 min，共30個循環(huán)；72 ℃6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.5 衛(wèi)星試驗及生化鑒定

取一塊沒有添加NAD的TSA血清平皿，在平板中間沿直徑線涂劃接種金黃色葡萄球菌，然后將疑似菌落垂直金黃色葡萄球菌線劃線接種，37 ℃，培養(yǎng)24 h后觀察是否出現(xiàn)靠近金黃色葡萄球菌線的菌落長勢較好，遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌線的地方無菌落生長的衛(wèi)星現(xiàn)象。

選取生化鑒定試管進(jìn)行試驗，特別注意在進(jìn)行生化鑒定時，需要在生化鑒定管內(nèi)添加適量NAD。

1.3.6 藥敏試驗

挑取疑似單個菌落接種于TSB+血清+NAD培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)5～6 h，取100μL均勻涂布于含TSA+血清+NAD培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）[3]進(jìn)行藥敏試驗，選取頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考為試驗藥物，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株對所選藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

菌落形態(tài)為圓形隆起、表面光滑、邊緣整齊、小而透明的菌落（圖2），革蘭氏染色為陰性桿菌（圖3）。

圖2 菌落形態(tài)

圖3 革蘭氏染色鏡檢（1 000×）

2.2 分子鑒定結(jié)果

從豬藍(lán)耳病毒分子鑒定電泳圖結(jié)果（圖4），可以看到在第2、3泳道出現(xiàn)430 bp左右的特異性條帶，與我們設(shè)計引物擴(kuò)增的藍(lán)耳病病毒基因片段長度相符。

取單個純化且具有典型特點(diǎn)的菌落 進(jìn)行PCR鑒定，并設(shè)陽性和陰性對照，陽性對照電泳結(jié)果條帶大小為821 bp左右，樣品條帶大小也為821 bp左右，陰性對照無條帶，根據(jù)結(jié)果判定為副豬嗜血桿菌，結(jié)果如圖5。

圖4 藍(lán)耳病毒分子鑒定結(jié)果

圖5 副豬嗜血桿菌分子鑒定結(jié)果

2.3 ERIC-PCR指紋圖譜結(jié)果分析

分離菌株進(jìn)行ERIC-PCR指紋圖譜分析，如圖6，將得到的ERIC-PCR指紋圖譜與學(xué)者Rafiee等發(fā)表的15種標(biāo)準(zhǔn)血清型的指紋圖譜進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株的圖譜與血清型5型的圖譜高度相似，并進(jìn)行血清型驗證，鑒定結(jié)果為血清型5型。

圖6 ERIC-PCR結(jié)果

2.4 衛(wèi)星試驗及生化鑒定結(jié)果

從圖7可看出，分離株在靠近金黃色葡萄球菌直線處生長較好，而遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌的地方基本沒有細(xì)菌生長。

從表1不難看出，分離到的菌株不發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，氧化酶和尿素酶陰性，硝酸鹽還原酶和接觸酶陽性，靛基質(zhì)和VP試驗陰性。與副豬嗜血桿菌的生化特性一致。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

挑取分離到的副豬嗜血桿菌進(jìn)行藥敏試驗，敏感藥物為頭孢噻呋、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考。

表1 生化鑒定結(jié)果

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 總結(jié)

本次檢測結(jié)果為豬藍(lán)耳病毒陽性，副豬嗜血桿菌血清型5型陽性，根據(jù)其發(fā)病機(jī)理判斷為豬藍(lán)耳病繼發(fā)副豬嗜血桿菌。豬藍(lán)耳病是一種免疫抑制類疾病，尚無有效的治療措施，對其防治應(yīng)從以下幾個方面進(jìn)行。1)引種傳播是其傳播的重要途徑，因此應(yīng)堅持自繁自養(yǎng)，不從疫區(qū)和有過該病發(fā)病史的豬場引種是一種重要的預(yù)防措施 。2)嚴(yán)格控制豬舍環(huán)境，要嚴(yán)格執(zhí)行消毒制度，建立無毒清潔豬場，另外加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時調(diào)整豬群飼養(yǎng)密度，改善豬舍通風(fēng)采光，病毒的穩(wěn)定性受pH和溫度的影響較大，在pH小于5或大于7時，其感染力降低95%以上，豬舍內(nèi)可用pH較低的消毒液采用疫病期間的用藥劑量帶豬噴霧消毒，包括豬舍內(nèi)的用具每天徹底消毒。3)做好豬藍(lán)耳病免疫接種工作，商品仔豬在斷奶之后進(jìn)行初次免疫，每頭豬2 mL，在疫情暴發(fā)地區(qū)在初次免疫后30 d采用相同劑量進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，后備種豬在150日齡再次進(jìn)行免疫，每頭豬4 mL，母豬和種公豬每隔4個月進(jìn)行免疫1次，每次每頭4 mL。4)一旦豬場發(fā)病，要盡快將病豬隔離治療，而且主要從兩個方面進(jìn)行，一個方面是提高發(fā)病豬只的抵抗力，添加如黃芪多糖和復(fù)方花青素以增強(qiáng)畜體抗病毒、細(xì)菌感染的抵抗力，另一方面是使用抗生素，緩解癥狀和防止繼發(fā)感染，如將泰樂菌素、磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐氨嘧啶拌入飼料。5)建立免疫檔案，做好疫病監(jiān)測，定期對免疫豬進(jìn)行抗體檢測，并根據(jù)抗體水平高低及時加強(qiáng)免疫，一般每季度監(jiān)測1次，對各階段的豬群進(jìn)行采樣抗體監(jiān)測，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行免疫效果及疫情分析。

副豬嗜血桿菌的防治，需要加強(qiáng)主要病毒性疾病的免疫、選擇有效的藥物組合對豬群進(jìn)行常規(guī)的預(yù)防保健、改善豬群飼養(yǎng)管理等。對于副豬嗜血桿菌的治療應(yīng)從兩方面進(jìn)行，一是注射抗生素，通過藥敏試驗篩選出敏感藥物，結(jié)合臨床情況，選擇合適藥物。二是副豬嗜血桿菌和其他的革蘭氏陰性菌一樣可以產(chǎn)生內(nèi)毒素，所以使用藥物時要充分考慮到內(nèi)毒素的影響，否則會出現(xiàn)使用藥物后，癥狀不但不減輕反而加重的情況，因此通過在飼料中添加對內(nèi)毒素有頡頏作用的黃芪多糖、淫羊藿等藥物[5]，以達(dá)到輔助治療的效果。

[1] 張盼鋒，仇微，劉宇，等． 副豬嗜血桿菌PCR快速診斷方法的建立[J]． 廣東畜牧獸醫(yī)科技 ，2009（1）：33-36．

[2] RAFIEE M， BARA M， STEPHENS C P ，e t a l．A p p l i c a t i o n o f ERIC PCR for the comparison of isolates of Haemophilus parasuis[J]． Australian Veterinary Journal，2001，78(12)：846-849．

[3] 譚瑤，趙清，舒為群，等．K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗[J]．檢驗醫(yī)學(xué)與臨床 ，2010，7（20）：2290-2291．

[4] 周雪瑞． 高致病性豬藍(lán)耳病及其防治[J]． 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2010， 49(5)：1153-1154．

[5] 王立新， 韓哲武． 黃芪多糖對內(nèi)毒素致小鼠毒性損傷的作用[J]． 藥學(xué)學(xué)報，1992， 27(1)：5-9．