張士發(fā) 邢雪莎 趙麗萍 王艷紅 羅 陽

原發(fā)性皮膚淀粉樣變(Primary Cutaneous Amyloidosis，PCA)是一種慢性皮膚病，以淀粉樣蛋白沉積在既往正常皮膚內為主要表現(xiàn)，無其他器官受累。目前已有研究證實，定位于5p13.1處的抑瘤素M受體(Oncostatin M receptor，OSMR)基因和定位于5q11.2處的IL-31受體A(IL-31RA)基因的突變與PCA相關[1,2]。我們對一PCA家系的OSMR基因進行了檢測，進一步證實PCA的致病基因。

1 對象與方法

1.1 病例資料 先證者III6，女，26歲。8年前背部及四肢出現(xiàn)散在褐色粟粒大斑、丘疹，逐漸密集成片，并向四肢屈側蔓延，伴有明顯瘙癢。近2個月病情加重，皮疹逐漸增多，瘙癢明顯，影響睡眠，于2013年1月25日來我院就診。皮膚科情況：背部及四肢伸側皮膚可見褐色斑及斑丘疹，密集片狀分布，對稱分布，界限不清，部分融合成串珠狀，部分丘疹表面有少量白色薄屑及少量抓痕(圖1)。體檢：各系統(tǒng)檢查未見異常。實驗室檢查：血、尿常規(guī)，肝、腎功能、血脂、血糖、電解質檢查，結果均正常。心電圖、胸片正常?；颊?年前背部皮損病理組織學檢查顯示：角質層角化過度，棘細胞層略增厚，基底細胞層液化；真皮乳頭層可見淀粉樣蛋白沉積，有裂隙，其上表皮略薄。真皮淺層少量淋巴細胞小片狀浸潤及噬黑素細胞(圖2、3)。甲紫染色陽性(圖4)。臨床診斷：原發(fā)性皮膚淀粉樣變(斑狀)。取得先證者及其家系成員知情同意后對其家系進行調查。

2 方法

2.1 DNA提取 取得知情同意后，采集家系23個家系成員外周靜脈血各5 mL，EDTA抗凝，大連寶生物有限公司試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)提取基因組DNA。

圖1 后背上部可見褐色斑及斑丘疹，部分融合成串珠狀，密集片狀對稱分布圖2 角質層角化過度，角質層角化過度，棘細胞層略增厚(HE，×100)圖3 真皮乳頭層可見淀粉樣蛋白沉積，淺層少量淋巴細胞小片狀浸潤(HE，×200)圖4 甲紫染色真皮乳頭可見異染性團塊狀物質沉積(×200)

表1 OSMR引物序列及退火溫度

2.2 PCR擴增 以患者基因組DNA為模板，應用多聚酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增 OSMR基因各外顯子及外顯子內含子交接片段。PCR引物序列和退火溫度見表1；PCR反應總體積為50 μL，包括2×GC buffer I 25 μL， dNTP(2.5 mmol/L)8 μL，上下游引物(10 pmol/L)各2.5 μL，LA Taq(5U/μL) 0.5 μL，基因組DNA約40 ng，無菌水定容至50 μL。反應條件為：95℃預變性5 min；94℃ 變性30 sec，退火30 sec，72℃延伸1 min，循環(huán)35次后總延伸72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)股份有限公司測序。測序結果與UCSC數(shù)據(jù)庫基因組序列進行比對分析，分析樣本是否存在突變情況，此外，通過人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)(www.genecards.org)確定該位點是否為新的突變位點。

3 結果

3.1 家系調查 先證者家族3代共有25人，患者4例(I1已故)，先證者及先證者母親、舅舅、外祖父均有類似皮損(圖1)，余家系人員無明顯類似皮損。先證者父母非近親婚配，沒有其他遺傳相關性疾病。該家系代代發(fā)病，父母雙方正常者，其子女均正常，符合常染色體顯性遺傳方式(圖5)。

圖5 PCA家系圖：25個家系成員中有4例患者

先證者母親(II5)，女，56歲，皮疹與先證者相似，主要分布于四肢，為原發(fā)性皮膚淀粉樣變(斑狀)，病史27年。先證者舅舅(II1)，男，60歲。雙上肢伸側及雙小腿脛前可見散在分布淡褐色粟粒至綠豆大丘疹，部分融合成串珠樣，高于皮膚，系原發(fā)性皮膚淀粉樣變(苔蘚樣)，病史33年。先證者外祖父(I1)，已故，有類似皮疹，但病情不詳，不能分型。

3.2 基因突變檢測 先證者OSMR基因的第15外顯子中檢測出錯義突變c.2081C>T(p.Pro694Leu)(圖6)，其家系中的其他2例患者也攜帶相同的突變位點，而其家系內的正常人未見異常。

4 討論

PCA是由一種或多種蛋白質與粘多糖結合而成的蛋白復合體沉積于血管壁、纖維組織、黏膜和腺體等基底膜及真皮層所致的慢性皮膚病[1,3]，根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為苔蘚樣淀粉樣變、斑狀淀粉樣變、原發(fā)性限局性結節(jié)性皮膚淀粉樣變、結節(jié)萎縮型皮膚淀粉樣變、皮膚異色病樣淀粉樣變、腰骶骨部皮膚淀粉樣變和摩擦性皮膚淀粉樣變等[4]。本文3例患者也分屬于前2種不同的臨床亞型。

圖6 PCR擴增，基因測序圖，顯示c.2081C>T(p.Pro694Leu)錯義突變

2010年，Lin等[2]首次將PCA的染色體突變位點定位于5號染色體的OSMR基因及IL-31受體A基因。家族性原發(fā)性局限性皮膚淀粉樣變(familial primary localized cutaneous amyloidosis， FPLCA)家系中，致病的雜合子錯義突變位于OSMR基因，該基因可編碼OSM特異性受體β亞基[5]和IL-6受體α[6]。OSMR基因和IL-31RA基因分別編碼OSM受體β亞基和IL-31RA，二者可影響Jak/STAT、MAPK和 PI3K/Akt 活性，均屬于IL-6型受體[5]，該受體影響角質形成細胞的增殖、分化與凋亡，與FPLCA皮損的形成有關。中國一PLCA家系中先證者OSMR基因的第13位外顯子發(fā)生雜合1845A>T突變[7]。另有報道29例PCA家系患者IL-31RA 基因上由c.1562C>T點突變所致的致病突變位于OSMR突變中III型纖維蛋白原重復區(qū)域[2]。目前已報道的PCA 相關OSMR基因突變，均為位于OSM受體 β亞基細胞外III型纖維蛋白控制區(qū)域的錯義突變，如p.P694L，p.K697T和p.KD647V位點[1]，以及p.I691T和p.G618A位點[2]。

本家系3例患者顯示出家族遺傳特征：3代25人中4例患者，男、女各2例，發(fā)病年齡18～29歲。遺傳方式和家系基因型分析顯示，該家系3代均有患者，呈垂直連續(xù)遺傳，發(fā)病與性別無關，夫妻健康者子女不發(fā)病，符合常染色體顯性遺傳方式。該家系3例PCA患者OSMR基因第15號外顯子均檢測出c.2081位置C >T錯義突變，使氨基酸序列第694號脯氨酸轉變?yōu)榱涟彼?，而家系內正常人未檢測到該突變，與文獻[3,8]報道相同，說明本家系患者OSMR基因的第15外顯子錯義突變與PCA發(fā)病密切相關。也有報道色素異常性皮膚淀粉樣變病患者及其家系成員OSMR基因的第14、15外顯子和IL-31RA第12外顯子未發(fā)現(xiàn)突變[9]。一FPCLA家系中所有成員均未發(fā)現(xiàn) OSMR基因突變[10]，提示PCA的不同亞型可能存在遺傳學上的突變，但本文2種亞型均顯示一種突變。

[1] Arita K,South AP,Hans-Filho G,et al. Oncostatin M receptor-β mutations underlie familial primary localized cutaneous amyloidosis[J]. Am J Hum Genet,2008,82(1):73-80.

[2] Lin MW,Lee DD,Liu TT,et al. Novel IL31RA gene mutation and ancestral OSMR mutant allele in familial primary cutaneous amyloidosis[J]. Eur J Hum Genet,2010,18(1):26-32.

[3] 顏永祥,顏潔,秦保玲.皮膚淀粉樣變性三例家系調查[J].中華皮膚科雜志,2008,41(2):130-130.

[4] 戴迅毅,賴美玲,楊莉佳,等.原發(fā)性皮膚淀粉樣變一家系五例[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2012,29(2):245-245.

[5] Arita K,South AP,Hans-Filho G,et al. Oncostatin M receptor-β mutations underlie familial primary localized cutaneous amyloidosis[J]. Am J Hum Genet,2008,82(1):73-80.

[6] Tanaka A,Arita K,Lai-Cheong JE,et al.New insight into mechanisms of pruritus from molecular studies on familial primary localized cutaneous amyloidosis[J]. Br J Dermatol,2009,161(6):1217-1224.

[7] Wang W,Li L,Huang E,et al. A new c.1845A→T of oncostatin M receptor-β mutation and slightly enhanced oncostatin M receptor-β expression in a Chinese family with primary localized cutaneous amyloidosis[J]. Eur J Dermatol,2012,22(1):29-33.

[8] Heinrich P,Behrmann I,Haan S,et al. Principles of interleukin(IL)-6-type cytokine signalling and its regulation[J]. Biochem J,2003,374(Pt 1):1-20.

[9] 林楊楊,楊文林,楊健,等.色素異常性皮膚淀粉樣變的OSMR及IL31RA基因突變研究[J].皮膚性病診療學雜志,2012,19(2):69-73.

[10] Sakuma TH,Hans-Filho G,Arita K,et al. Familial primary localized cutaneous amyloidosis in Brazil[J].Arch Dermatol,2009,145(6):695.