薛麗麗+閆冰+杜歐+蘇若為+曾曉華+蔡巧玲

[摘要] 目的 研究不同脫礦程度牙本質的拉曼光譜特征，為臨床應用拉曼光譜技術檢測牙本質脫礦情況提供理論基礎。方法 方便收集2016年1—5月間廈門大學附屬第一醫(yī)院口腔門診拔除的下頜智齒10顆，經(jīng)過打磨去除表面牙釉質，制備牙本質組織標本，經(jīng)過不同濃度EDTA溶液和不同時間脫礦處理后，分別檢測其拉曼光譜，比較不同脫礦程度牙本質拉曼光譜間的差異，并以差異譜峰的對應波數(shù)繪制拉曼光譜圖像。同時應用能譜儀檢測不同脫礦程度牙本質表面的元素含量，驗證拉曼光譜結果。結果 該研究共獲得不同脫礦程度牙本質特征拉曼光譜共80例。通過比較研究發(fā)現(xiàn)，隨著牙本質脫礦程度的增加，拉曼光譜中代表磷酸根的960 cm-1波數(shù)處譜峰強度逐漸降低，表示牙本質表面磷酸鈣鹽減少，而代表C-H鍵的2 950 cm-1波數(shù)處譜峰強度逐漸增高，表示牙本質表面有機組織增加。能譜儀元素分析結果也提示隨著脫礦程度的增加，牙本質表面鈣、磷元素的濃度逐漸降低。結論 不同脫礦程度牙本質組織中磷酸鈣鹽含量降低，有機組織增加，拉曼光譜可以檢測不同脫礦程度牙本質組織成分變化，特別是以2 950 cm-1波數(shù)處光譜強度值兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），可以用于鑒別不同脫鈣程度的牙本質，具有良好的臨床應用潛力。

[關鍵詞] 牙本質；脫礦；拉曼光譜；鑒別

[中圖分類號] R783 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）12（c）-0022-05

[Abstract] Objective This paper tries to study the Raman spectra of dentin with different degree of demineralization， to provide a theoretical basis for the clinical application of Raman spectroscopy in detecting dentin demineralization. Methods 10 mandibular wisdom teeth extracted from the oral clinics of this hospital from January to May in 2016 were convenient collected. After grinding and removing the enamel， the dentin tissue specimens were prepared. After different concentrations of EDTA solution and demineralization treatment， the Raman spectra of the dentin samples were compared and their Raman spectra were compared. The Raman spectra were compared with the corresponding wavenumber of the different peaks. At the same time， the content of element on the surface of dentin with different degree of demineralization was detected by energy spectrometer， and the result of Raman spectroscopy was verified. Results In this study， a total of 80 cases of different characteristics of demineralization of dentin Raman spectra were obtained. Through the comparative study， with the increase of dentin demineralization， the peak intensity of the 960 cm-1 wavenumber representative of phosphate radical in Raman spectrum gradually decreases， indicating that the calcium phosphate salt on the surface of dentin decreases while the 2 950 cm-1 wave number at the peak intensity gradually increased， indicating that the dentine surface organic tissue increases. The results of elemental analysis also indicated that the concentration of calcium and phosphorus decreased gradually with the increase of demineralization. Conclusion The content of calcium phosphate in dentine tissue with different degree of demineralization is decreased and the organic structure is increased. Raman spectroscopy could detect the change of dentin tissue composition with different degree of demineralization. Especially， the spectral intensity at 2 950 cm-1 was compared with each other for The difference was statistically significant（P<0.05）， which can be used to identify the degree of decalcification of dentin， has good potential for clinical application.endprint

[Key words] Dentin； Demineralization； Raman spectroscopy； Identification

臨床上牙體缺損修復主要采用樹脂、玻璃離子、金屬冠及全瓷冠等材料，這些材料與牙體組織通過不同的粘結材料來實現(xiàn)固位[1]?，F(xiàn)有的粘結體系是通過酸蝕牙本質，在牙本質表層形成脫礦層，暴露牙本質表層的膠原纖維和牙本質小管，改變牙本質表面性狀，使得粘結材料可以滲入牙本質脫礦后的膠原纖維網(wǎng)架和牙本質小管中，形成混合層或樹脂突來獲得微機械固位力[2]。隨著對牙本質表面形態(tài)及粘結系統(tǒng)認識的逐漸深入，改善牙本質表面性能的表面處理成為提高粘結性能的關鍵[1]。牙本質表面采用不同的磨削處理，可以形成不同厚度、密度及其他性質的玷污層，因此不同的牙本質表面處理，會對牙本質與自酸蝕粘結劑之間的粘結強度產(chǎn)生一定的影響[3]。目前，臨床應用的粘結體系主要應用酸蝕劑對牙本質表面進行脫礦處理，但尚無針對個體化牙體組織的設計，如硬化性牙本質所需的粘結時間可能較普通牙本質長，且臨床上尚無技術或方法能夠檢測和鑒定不同粘結材料對不同牙本質表面處理程度。拉曼光譜技術是基于拉曼散射效應的振動光譜技術，通過激發(fā)光與散射光波長的變化來反應樣本分子結構的改變或組成成分的變化，目前被廣泛應用于醫(yī)學研究領域，如腫瘤組織的鑒別診斷、體液分析、硬組織成分研究等[4-6]。拉曼光譜技術的優(yōu)點是對測試組織無損傷，無需特別處理，且快速準確，是一種具有實時、快速、無創(chuàng)、準確的檢測新方法，特別適用于樣本的表面性狀研究[7]。因此，該研究擬采用拉曼光譜技術對不同脫礦程度的牙本質表面進行研究，比較不同脫礦程度的牙本質表面光譜差異，以期為臨床上應用拉曼光譜檢測牙本質酸蝕程度提供理論基礎，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便收集廈門大學附屬第一醫(yī)院口腔科拔除的下頜智齒10顆作為牙本質組織樣本。患者年齡為25～28歲之間，性別比約為1∶1。納入標準：患者無牙體硬組織疾患，無全身系統(tǒng)性疾病。排除標準：牙本質過敏或牙周炎患者?；颊咝g前均簽署了知情同意書，該研究獲得廈門大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會的批準。將收集的離體磨牙經(jīng)過去除表面纖維結締組織、75%酒精浸泡消毒后，采用TR-26型號（藍標）車針去除牙體組織表面釉質，TR-13F型號（紅標）車針打磨，TR-26EF型號（黃標）車針拋光。再依次使用目數(shù)800、1 500、2 000的砂紙對表面進行拋光，去除牙本質表面雜質。然后將牙體組織制備成約5 mm×5 mm組織塊備用。

1.2 牙本質的脫礦處理

該研究共收集下頜智齒10顆，每顆智齒共制備2個牙本質組織樣本，共20個牙本質樣本。首先將未脫礦處理的牙本質樣本直接進行拉曼光譜檢測，獲得特征光譜。之后將牙本質樣本依次經(jīng)過濃度10%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min、15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min以及15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡30 min后分別進行拉曼光譜檢測，獲得不同脫鈣程度的牙本質拉曼光譜。

1.3 拉曼光譜檢測

將制備好的牙本質標本放置在顯微拉曼光譜儀Nanophoton Raman-11載物臺，參數(shù)設定為785 nm激光為激發(fā)光，功率為600 mW，每個牙體組織樣本檢測區(qū)域面積設定為160 μm×80 μm，掃描時間為20 s，平均累加2次取平均值為該樣本的拉曼光譜。光譜波數(shù)記錄范圍為400～4 500 cm-1，分辨率為2 cm-1。同時采用Raman Imager軟件以光譜波數(shù)2 950 cm-1和960 cm-1繪制牙本質的拉曼光譜圖像與顯微鏡下圖像進行比較分析。

1.4 能譜儀分析牙本質表面成分

將不同脫礦程度的牙本質組織樣本依次通過Quanta-250型X射線能譜儀EDS 進行牙本質組織樣本表面成分分析，選取牙本質表面中心區(qū)域進行鈣、磷、碳、氧、鎂等元素成分分析。

1.5 統(tǒng)計方法

采用LABSPEC 2.0軟件去除牙本質組織拉曼光譜的熒光背景、消除噪音信號并對光譜數(shù)據(jù)進行平滑處理。應用Origin 8.0軟件對處理后數(shù)據(jù)進行分析，會診光譜圖像，同時通過歸一化處理以光譜波數(shù)2 950 cm-1和960 cm-1平均光譜強度繪制柱形圖，比較不同脫礦程度牙本質的譜峰強度。同時對960 cm-1和2 950 cm-1兩個波數(shù)處光譜強度進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

該研究共獲得未脫礦處理的牙本質組織特征拉曼光譜20例，不同脫礦程度的牙本質組織特征拉曼光譜60例，共80例。通過平均光譜比較可以看出，在450～4 500 cm-1波段區(qū)域內，牙本質組織主要表現(xiàn)為960 cm-1與2 950 cm-1兩個波數(shù)譜峰明顯增強，其中960 cm-1表示磷酸根特征譜峰，與牙本質硬組織磷酸鈣鹽成分相關。而2 950 cm-1表示為C-H鍵特征譜峰，與牙本質硬組織中有機成分相關（圖1）。比較不同脫礦程度的牙本質組織特征拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)，隨著脫礦程度的逐漸增加，960 cm-1波數(shù)處的拉曼光譜譜峰強度逐漸降低，表示牙本質表面的磷酸鈣鹽成分逐漸減少，而2 950 cm-1波數(shù)處的拉曼光譜譜峰強度逐漸增強，表示牙本質表面的有機組織成分逐漸增加（圖2）。通過歸一化處理的960 cm-1與2 950 cm-1波數(shù)處的柱狀圖同樣提示，隨著脫鈣程度的不斷增加，牙本質表面的磷酸鈣鹽成分逐漸減少，而牙本質表面的有機組織成分逐漸增加。分別以960 cm-1與2 950 cm-1波數(shù)處光譜強度兩兩間進行比較，其中960 cm-1波數(shù)處光譜兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而2 950 cm-1波數(shù)處光譜兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

通過Raman Imager軟件分別以960 cm-1和2 950 cm-1波數(shù)的拉曼光譜強度繪制拉曼圖像，與顯微鏡下圖像相比，960 cm-1波數(shù)處譜峰表示磷酸鹽的含量，圖像呈現(xiàn)模糊不清，無法表現(xiàn)牙本質表明情況。而以2 950 cm-1波數(shù)處譜峰繪制的拉曼圖像，表示了有機組織的含量，與顯微鏡下圖像相比，可以清洗的表現(xiàn)牙本質小孔的結構，與顯微鏡圖像相近，同時隨著脫礦程度的不斷增加，其拉曼圖像表現(xiàn)的牙本質表面小孔的密度越來越高（圖3）。endprint

通過能譜儀對不同脫礦程度牙本質組織表面進行元素分析，未脫礦組牙本質組織表面鈣和磷的平均相對原子濃度為11.6%和7.6%，而經(jīng)過濃度10%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min后牙本質組織表面鈣和磷的平均相對原子濃度為9.5%和6.1%，而再次經(jīng)過15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min脫礦后的牙本質組織表面鈣和磷的相對原子濃度下降到了9.0%和6.0%，而后經(jīng)過15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡30 min脫礦處理后的牙本質組織表面，其鈣和磷的相對原子濃度則降至7.6%和5.2%。不同脫礦程度的牙本質能譜分析中鈣磷相對原子濃度的下降與脫礦程度呈正相關（圖4），與拉曼光譜檢測結果相一致。

3 討論

在臨床進行牙體缺損修復時，修復體脫落的情況時有發(fā)生，主要原因是粘接劑的粘接效果不佳所導致，這與粘接劑的選擇、修復體表面的處理以及牙本質表面處理等因素相關[1]。目前，臨床使用的粘接系統(tǒng)，不論是自酸蝕粘接系統(tǒng)還是全酸蝕粘接系統(tǒng)，均采用酸蝕處理牙本質表面，在臨床使用過程中，醫(yī)生按照說明進行操作，但對不同性質的牙本質組織沒有個性化的酸蝕處理，均采用單一的操作步驟和酸蝕處理時間，這就導致了不同牙本質表面的酸蝕效果不同，從而影響了后期粘接效果[8]。因此，隨著今年來的研究，對牙本質表面形態(tài)及粘接系統(tǒng)不斷深入的了解，國內學者將改善牙本質表面性能作為提高粘接性能的研究重點[9-10]。但是在臨床酸蝕過程中，醫(yī)生無法依靠復雜的實驗室儀器來實時、快速、準確地判斷不同礦化程度牙本質表面酸蝕處理的情況，因此，提供一種快速、準確、便捷的檢測牙本質酸蝕程度的方法可以幫助臨床醫(yī)生更好地判斷牙本質酸蝕情況，提高修復體與牙本質粘接性能。

拉曼效應是由印度科學家Raman于1928年發(fā)現(xiàn)[11]，并因此而獲得諾貝爾物理學獎。其主要原理是根據(jù)分子及分子團對入射激光產(chǎn)生非彈性散射形成的光譜（即拉曼光譜）來分析分子及分子團的結構，分子鍵能之間的變化及特定分子的含量等，被譽為“分子指紋”[12]。近年來隨著激光技術及儀器的不斷發(fā)展，拉曼光譜技術被廣泛應用于醫(yī)學研究領域，為醫(yī)學領域研究，特別是對疾病鑒別診斷、生物樣該組織無創(chuàng)檢測等研究提供了一種便捷而準確的新方法[13-14]。薛麗麗等[14]應用拉曼光譜對唇腺炎癥組織進行研究發(fā)現(xiàn)，正常唇腺組織與慢性炎癥唇腺組織的拉曼光譜存在差異，通過分析比較光譜差異，建立鑒別診斷模型，可以應用拉曼光譜對慢性炎性唇腺組織進行鑒別診斷，準確率達到了91.8%。拉曼光譜技術不但能夠用于軟組織病變的檢測研究，同樣也適用于硬組織變化的檢測研究。Lakshmi等[14]應用拉曼光譜技術研究下頜骨放射性骨髓炎病變，發(fā)現(xiàn)960 cm-1波數(shù)處譜峰對應骨骼中的磷酸鈣鹽成分，而2 950 cm-1波數(shù)處譜峰對應骨骼中有機組織的C-H鍵。發(fā)現(xiàn)放射性骨髓炎組織內結構發(fā)生改變，細胞成分降低，隨著骨骼內鈣磷成分減少， 960 cm-1波數(shù)處譜峰強度降低，而隨著有機成分的增加2 950 cm-11波數(shù)處譜峰強度增加。以上研究結果與該研究相似。目前，國內外有關牙體硬組織的拉曼光譜研究主要集中在釉質表面酸蝕及牙本質齲壞結構改變的研究，尚無關于牙本質脫礦拉曼光譜定量研究[16-17]。Lemor等[18]在研究牙本質化學酸蝕過程中同樣發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜中960 cm-1譜峰與牙本質中的磷酸鈣鹽相關。該研究中，不同脫礦程度的拉曼光譜存在差異，其中960 cm-1波數(shù)處譜峰對應磷酸根，其強度隨著脫礦程度的增加而降低，表明牙本質組織脫礦后羥基磷灰石[Ca10（OH）2（OP4）6]成分減少，這與能譜儀分析牙本質組織表面元素成分相近。而2 950 cm-1波數(shù)處譜峰對應的是有機組織成分，其強度隨著脫礦程度的增加而增加，說明隨著鈣磷酸鹽的減少，有機組織成分占比逐漸升高。相關研究表面EDTA處理牙本質表面時可以將接近牙本質小管開口5 μm內的鈣鹽沉積物全部或大部分溶解[10]。而通過拉曼光譜圖像對比，可以更直觀地觀察牙本質組織表面牙本質小孔的變化，從而了解牙本質表面脫礦程度及酸蝕處理情況。

綜上所述，拉曼光譜可以檢測不同脫礦程度的牙本質組織，主要表現(xiàn)為磷酸根對應的960 cm-1處譜峰及與有機組織相關的C-H鍵對應的2 950 cm-1處譜峰。隨著脫礦程度的變化，拉曼光譜的譜峰也隨之改變。表面拉曼光譜可以有效地檢測牙本質表面組織的礦化程度及變化情況，可以為臨床提供一種快速、便捷、準確、無創(chuàng)及原位實時檢測牙本質組織的新方法，具有巨大的應用潛力，但拉曼光譜譜峰強度變化與牙本質脫礦程度的定量關系需要進一步大樣本量的研究。

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（收稿日期：2017-09-23）endprint