吳夏雷 董黎 孫宇涵 胡瑞陽(yáng) 鄭會(huì)全 胡德活 李云

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心) (廣東省林業(yè)科學(xué)研究院) (北京林業(yè)大學(xué))

杉木(Cuiminghamialanceolata(Lamb.) HooK)是我國(guó)南方特有的多年生針葉用材樹(shù)種，距今已有3 000多年的栽培歷史，主要分布于我國(guó)秦嶺地區(qū)、長(zhǎng)江流域以南以及臺(tái)灣山區(qū)，南北約跨10個(gè)緯度，東西約15個(gè)經(jīng)度，海拔最高可達(dá)1 800 m以上[1]。杉木具有生長(zhǎng)快、材性?xún)?yōu)良的特點(diǎn)，是我國(guó)重要的商品材，用途廣泛[2]。近年來(lái)對(duì)杉木的研究多集中在雜交育種、良種繁育、材性提高等方面，而杉木的分子遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)比較薄弱，早期開(kāi)發(fā)出來(lái)的分子標(biāo)記，因其標(biāo)記缺乏共顯性、多態(tài)性不高、操作復(fù)雜等原因，很大程度上限制了杉木分子育種的發(fā)展，氣候環(huán)境的變化急需集合速生、抗逆等特性的新種質(zhì)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)，又稱(chēng)微衛(wèi)星，是重復(fù)序列為2～6 bp的單元，它們均勻分布于基因組中，是重復(fù)序列中主要組成部分之一[3-5]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列具有高度的保守性和專(zhuān)一性，可以特異地定位于染色體的某一位置，擴(kuò)增所得產(chǎn)物可以在高分辨率的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳加以分離，可以檢測(cè)出不同個(gè)體在每個(gè)SSR位點(diǎn)上遺傳結(jié)構(gòu)的差異[6-7]。

SSR標(biāo)記主要包括基于基因組序列開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記(Genomic-SSR)和基于表達(dá)序列開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記(EST-SSR)。據(jù)研究表明，相對(duì)于目前使用的大多數(shù)分子標(biāo)記[8-11]，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種等方面[12]，但從基因組開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記，存在步驟繁雜、成本高、效率低等缺點(diǎn)。表達(dá)序列標(biāo)記(EST)來(lái)源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，與功能基因緊密連鎖，能夠直接反映基因的表達(dá)信息，同時(shí)也避免了構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)等繁雜的步驟[13-14]。目前杉木已經(jīng)開(kāi)發(fā)得到的標(biāo)記主要針對(duì)遺傳圖譜、核心種質(zhì)資源構(gòu)建、材性等經(jīng)濟(jì)性狀，缺少與抗逆相關(guān)的標(biāo)記。本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得的干旱脅迫下杉木的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)，開(kāi)發(fā)得到一組多態(tài)性較好的杉木EST-SSR標(biāo)記，為今后杉木的遺傳多樣性分析、逆境脅迫響應(yīng)等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

杉木材料來(lái)自中國(guó)廣東的杉木良種基因型“GZ7”首先經(jīng)組織培養(yǎng)擴(kuò)繁得到組培苗，并種植于營(yíng)養(yǎng)缽(營(yíng)養(yǎng)缽底部直徑13 cm、高17 cm、上口直徑18 cm)，種植所用營(yíng)養(yǎng)土由V(泥炭土)∶V(沙)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶1∶1∶1的均勻混合而成。試驗(yàn)以基因型“GZ7”15～20 cm高的1年生杉木組培苗為干旱脅迫處理材料。

SSR擴(kuò)增所用材料取自2014年在中國(guó)廣東省龍山國(guó)家森林農(nóng)場(chǎng)收集的300份杉木核心種質(zhì)中大于0.02遺傳距離的24份種質(zhì)，取當(dāng)年生杉木嫩葉，液氮速凍后保存于冰箱中-80 ℃?zhèn)溆?。初篩引物所用的8份杉木種質(zhì)隨機(jī)取自上述24份種質(zhì)。

1.1 干旱脅迫處理

試驗(yàn)所需的25株組培苗培養(yǎng)于北京林業(yè)大學(xué)人工氣候室，培養(yǎng)條件為70%相對(duì)濕度，25 ℃ 16 h光照與20 ℃ 8 h黑暗交替，光照強(qiáng)度為200～250 μmol·m-2·s-1。將25株的組培苗平均分為5組，包括正常澆水的5株苗作為對(duì)照，3個(gè)不同程度的干旱脅迫處理組(輕度、中度、重度)，和一個(gè)復(fù)水處理組。從對(duì)照及各個(gè)處理中隨機(jī)挑選3株組培苗，取頂端約5 cm長(zhǎng)帶針葉莖段進(jìn)行液氮速凍之后放到冰箱-80 ℃保存用于總RNA提取。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將對(duì)照及各處理的3株組培苗莖段在液氮中研磨成粉末，等量混合后提取總RNA。依據(jù)EASYspin植物RNA提取試劑盒使用說(shuō)明抽提總RNA，總RNA質(zhì)量經(jīng)電泳及RNA完整度檢驗(yàn)合格后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

杉木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以二代高通量測(cè)序技術(shù)，在Solexa mRNA-Seq平臺(tái)上對(duì)試驗(yàn)材料提取的總RNA進(jìn)行測(cè)序[15]。使用CLC Genomics Workbench軟件(version:6.0.4)[16-18]對(duì)預(yù)處理后的杉木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭測(cè)序拼接，序列的質(zhì)量控制參數(shù)為：字長(zhǎng)=45，最小重疊長(zhǎng)度≥300，得到初始非重復(fù)序列。再應(yīng)用CAP3 EST拼接軟件對(duì)初始非重復(fù)序列進(jìn)行第二次拼接，得到一個(gè)最終非重復(fù)序列集合。

1.3 EST-SSR挖掘和引物設(shè)計(jì)

用MISA軟件對(duì)得到的非重復(fù)序列進(jìn)行EST-SSR分析，查找標(biāo)準(zhǔn)：二、三、四、五、六核苷酸的重復(fù)數(shù)分別大于6、5、5、5、5次；EST-SSR位點(diǎn)兩側(cè)序列長(zhǎng)度≥50 bp。

隨機(jī)挑選120個(gè)EST-SSR，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，并用Oligo 7進(jìn)行驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)置的主要參數(shù)為:GC含量40%～70%，退火溫度55～63 ℃，引物長(zhǎng)15～30 bp，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度200～400 bp，無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體。

EST-SSR引物于2015年11月由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，并利用合適的熒光進(jìn)行修飾得到可用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)的熒光引物,引物用LX加序號(hào)命名，如LX-1。挑選遺傳距離較遠(yuǎn)的8份杉木DNA樣品通過(guò)PCR擴(kuò)增和8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)120對(duì)引物進(jìn)行初步篩選。

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

用大于0.02遺傳距離的24份杉木DNA材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增混合物體系為20 μL，其中含有10 μL 2×2xTSINGKE?Master Mix(藍(lán)色)(北京擎科生物科技有限公司)，7 μL無(wú)RNase水，1 μL正向引物(含有熒光標(biāo)記FAM和HEX)、1 μL反向引物和1 μL基因組DNA(30 ng/L)。PCR的程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，55～63 ℃退火30 s(其中55～63 ℃是選擇其中最佳的退火溫度)，72 ℃下延伸30 s。最后，在72 ℃下延伸10 min，4 ℃保溫。所得擴(kuò)增產(chǎn)物交由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GeneMarker V2.2.0軟件分析毛細(xì)管電泳結(jié)果，得到基因型數(shù)據(jù)(如果只擴(kuò)增出1條帶，則按純合基因型處理)；利用Convert v1.31軟件轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)格式，用于后續(xù)分析；利用POPGEN v1.32軟件計(jì)算等位基因數(shù)；有效等位基因數(shù)；觀測(cè)雜合度、期望雜合度和多態(tài)性信息指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下杉木轉(zhuǎn)錄組序列拼接

對(duì)杉木轉(zhuǎn)錄組序列拼接結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表1)，共得到75 357個(gè)片段重疊群，總長(zhǎng)度65.29 Mb，平均長(zhǎng)度867 bp，總序列的GC含量為39.4%。核苷酸長(zhǎng)度在200～400 bp的片段重疊群數(shù)量最多，有24 948個(gè)，占總片段重疊群數(shù)的33.11%，其次是核苷酸長(zhǎng)度在400～600 bp的片段重疊群數(shù)量，有19 633個(gè)，占總片段重疊群數(shù)的26.05%。拼接序列中最大拼接長(zhǎng)度為26 392 bp，N75長(zhǎng)度為552 bp，N50長(zhǎng)度為1 289 bp，N25長(zhǎng)度為2 430 bp。

2.2 干旱脅迫下杉木轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR位點(diǎn)的分布特點(diǎn)

在轉(zhuǎn)錄組共75 357條非重復(fù)序列中有7 326個(gè)潛在EST-SSR位點(diǎn)，分布頻率(與總非重復(fù)序列數(shù)量之比)為9.72%，其中單核苷酸型位點(diǎn)有4 943個(gè)。在總計(jì)2 383個(gè)復(fù)合型和二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型的EST-SSR中，復(fù)合型有384個(gè)，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型分別有925、982、67、11、14個(gè)，平均長(zhǎng)度分別為15.70、16.96、22.85、25.45、31.71、60.37 bp。杉木轉(zhuǎn)錄組序列中平均47.66 kb就能發(fā)現(xiàn)1個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，在2 383個(gè)EST-SSR位點(diǎn)中共包含525種重復(fù)單元，復(fù)合型、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型EST-SSR分別有384、11、61、44、11、14種，其中復(fù)合型、五、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型EST-SSR每種重復(fù)單元的數(shù)量只有1個(gè)(表2)。出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)單元類(lèi)型是AT/TA(453次)，占總EST-SSR的19.01%，其次是AG/TC(149次)，占總EST-SSR的6.25%，同時(shí)，在二核苷酸重復(fù)類(lèi)型中還發(fā)現(xiàn)了少量的CG重復(fù)(2次)。

表1 杉木轉(zhuǎn)錄組CLC拼接結(jié)果

干旱脅迫下杉木轉(zhuǎn)錄組中主要的EST-SSR重復(fù)類(lèi)型中，三核苷酸和二核苷酸重復(fù)類(lèi)型數(shù)量最多，分別占總EST-SSR數(shù)的41.21%和38.82%；復(fù)合型EST-SSR也較多，占總EST-SSR數(shù)的16.11%；四、五、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型EST-SSR數(shù)量很少，總計(jì)占3.86%。

表2 杉木錄組中EST-SSR重復(fù)單元的分布特征

2.3 干旱脅迫下杉木轉(zhuǎn)錄組EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

以8份杉木DNA樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)120對(duì)引物初步篩選，部分電泳結(jié)果如圖1所示，挑選電泳條帶好的引物，初選出24對(duì)引物用24個(gè)杉木DNA樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在24對(duì)引物中有23對(duì)引物檢測(cè)出特異性峰(以引物L(fēng)X-18為例(圖2))，只有1對(duì)引物沒(méi)有檢測(cè)出特異性峰。

M.DL100 DNA Marker;編號(hào)1～8的為引物L(fēng)X-18，編號(hào)9～16的為引物L(fēng)X-19，編號(hào)17～24的為引物L(fēng)X-20；編號(hào)25～32的為引物L(fēng)X-21。

圖2 引物L(fēng)X-18多態(tài)性峰

在24份杉木樣品中共檢測(cè)到94個(gè)等位基因，等位基因變異數(shù)范圍為2～9個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)有4.087 0個(gè)，其中，引物L(fēng)X-21、LX-77、LX-84、LX-87最少；LX-18、LX-47最多，有6對(duì)引物的等位基因數(shù)介于5～9個(gè)，9對(duì)引物的等位基因數(shù)為3個(gè)及以下；有效等位基因數(shù)范圍為1.086 8(LX-77)～6.914 3(LX-47)個(gè)，平均有效等位基因數(shù)2.089 0個(gè)；觀測(cè)雜合度范圍為0.250 0(LX-66)～1.000 0(LX-84)，平均0.648 7；期望雜合度范圍為0.082 4(LX-79)～0.896 1(LX-47)，平均0.429 0；多態(tài)性信息指數(shù)范圍是0.173 2(LX-77)～2.035 3(LX-47)，平均0.809 0，說(shuō)明所開(kāi)發(fā)的EST-SSR具有很高的多態(tài)性(表3)。

表3 23對(duì)EST-SSR引物在24份杉木樣品中的多態(tài)性結(jié)果

3 結(jié)論與討論

在干旱脅迫下杉木的轉(zhuǎn)錄組中，EST-SSR分布的頻率較高，為9.72%，高于火炬松(Pinustaeda)的1.2%，海岸松(Pinuspinaster)的2.1%，日本落葉松(Larixkaempferi)的3.85%[19-20]，其平均分布距離為47.66 kb。在EST-SSR重復(fù)類(lèi)型中，復(fù)合型和二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型都有出現(xiàn)，其中三核苷酸重復(fù)類(lèi)型EST-SSR最多，有982個(gè)，占總EST-SSR的41.21%，很多谷類(lèi)作物如小麥、水稻的EST-SSR研究中也是這種情況[21-22]。在二核苷酸重復(fù)單元中AT/TA(占總EST-SSR的19.01%)占主導(dǎo)地位，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了2次CG重復(fù)，表現(xiàn)出了明顯的偏倚性。值得注意的是，在干旱脅迫下杉木轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的復(fù)合型EST-SSR較多，有384個(gè)，占EST-SSR總數(shù)的16.11%，且復(fù)合模式多為三核苷酸與三核苷酸復(fù)合或三核苷酸與六核苷酸復(fù)合，這可能與生物的信使RNA分子上3個(gè)堿基決定1個(gè)氨基酸的模式有關(guān)，EST序列位于基因的編碼區(qū)，與功能基因緊密連鎖，且EST-SSR在生物適應(yīng)性進(jìn)化中起著重要的調(diào)控作用[23-25]，植物對(duì)逆境的應(yīng)答反應(yīng)或許很大程度上受EST-SSR變異的調(diào)控。本試驗(yàn)中，豐富的EST-SSR標(biāo)記說(shuō)明杉木可能以這些標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的基因的變異來(lái)適應(yīng)干旱脅迫。

毛細(xì)管電泳技術(shù)可以一次獲得多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息，具有效率高、成本低、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)[26]，可以利用該技術(shù)提高轉(zhuǎn)錄組中大量的多態(tài)性位點(diǎn)的選擇效率。本試驗(yàn)中，通過(guò)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳初選出的24對(duì)引物，用24個(gè)杉木DNA樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)有23對(duì)引物能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出有多態(tài)性的目的片段，只有1對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)多態(tài)性，這可能是該引物附近的序列復(fù)雜性比較低，也有可能是引物所在序列屬于多基因家族所致。在23對(duì)具有多態(tài)性的引物中，引物L(fēng)X-18、LX-47的等位基因變異數(shù)(Na)最多(9個(gè))，且這兩個(gè)引物的重復(fù)類(lèi)型都為三核苷酸重復(fù)，驗(yàn)證了低級(jí)重復(fù)單元SSR的多態(tài)性普遍比高級(jí)重復(fù)單元高的推斷[27]，因此在設(shè)計(jì)SSR引物時(shí)盡量多選擇含低級(jí)重復(fù)單元的序列。

在杉木的遺傳改良過(guò)程中，利用EST-SSR對(duì)種子園內(nèi)花粉種類(lèi)、花粉量的大小及其分布的進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而有效地提高種子園的經(jīng)營(yíng)管理水平。EST-SSR分子標(biāo)記也具有高可靠性的品種間鑒別能力，通過(guò)構(gòu)建主栽品種的EST-SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)和設(shè)置合理的品種鑒別相似性閾值，能夠有效的排除品種內(nèi)變異對(duì)分類(lèi)鑒定結(jié)果的干擾，更加客觀和準(zhǔn)確的對(duì)品種進(jìn)行分類(lèi)和鑒別。在林木育種中，EST-SSR標(biāo)記的應(yīng)用可以起到加快育種進(jìn)程、提高選擇效率的作用。試驗(yàn)得到的一組杉木EST-SSR分子標(biāo)記為研究杉木的遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)、DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建和遺傳信息的保存提供了基礎(chǔ)，對(duì)杉木遺傳結(jié)構(gòu)的演化方式及方向、遺傳改良策略的研究也具有重要意義。

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